DNA标记

分子标记技术在植物研究中的应用•分子遗传图谱的构建•遗传多样性与种质鉴定•重要农艺性状相关基因的定位•分子标记辅助选择•重要农艺性状的图位克隆分子标记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。分子标记来源于DNA水平的突变•突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。•多态性(Polymorphism)－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。植物遗传研究中常用的分子标记•RFLP—RestrictionFragmentLengthPolymorphism•RAPD—RandomAmplifiedPolymorphicDNAs(DAF,AP-PCR)•SSR—SimpleSequenceRepeat•AFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphism分子标记的分类（Staub等1996）分子标记以Southern为基础如RFLP以PCR为基础单引物PCR标记有RAPD、ISSR等双引物选择性扩增PCR主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记如SSR、STS等基于DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（singlenucleotidepolymorphism)。1.限制性片段长度多态性标记RestrictionFragmentLengthPolymorphism•RFLP：限制性片段长度多态性，为第一代多态性记。原理：RFLP是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，从而导致DNA酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。RFLP•原理：DNA限制性内切酶酶切电泳转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小•酶切：3-5ugDNA，以10U内切酶酶切5小时•电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时•染色：EtBr染色20分钟•变性：0.25MHCl20分钟，抽真空，水冼•印迹：加入0.4NNaOH，进行Southern印迹•冲洗：以2×SSC冼胶，风干酶切—电泳—印迹—杂交—洗脱预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5×HSB）中，封好后置65℃温箱中振荡5－6小时。杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65℃温箱中振荡过夜。洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65℃振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。—放射自显影将洗脱好的杂交膜置于增感屏上,于暗室中将X-光片放于杂交膜上，再放上另一张增感屏，装入暗袋，并用夹板夹好。置-70℃超低温冰箱中曝光10天左右。RFLP探针•来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针•cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。•gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。•玉米RFLP探针：标记特点共显性，可以区别纯合和杂合基因型稳定、重复性强无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响缺点：DNA需要量较大，需要对探针进行标记进行杂交，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低。2RAPD2RAPD•原理：用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。由单个短的随机序列引物对基因组进行PCR扩增，当两个反向互补引物结合位点间距离满足PCR扩增条件，就可以产生扩增片段。􀀹RAPD扩增产物的多态性是由于引物结合位点或结合位点间发生了重排、缺失或突变导致扩增产物的缺失。基因组中存在或长或短的被间隔开的颠倒重复序列WMWMRAPD原理示意图主要特点无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；DNA需要量少，引物便宜，成本较低；技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。不同物种间引物通用；缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。实验流程•DNA提取•PCR扩增•产物检测•数据纪录电泳图3SCARs（序列特异性区SequencedCharacterizedAmplifiedRegions）为提高RAPD标记稳定性，把目标RAPD片段克隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物（通常24个碱基），对基因DNA片段再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。具有更高的可重复性共显性4SSR分析两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。4SSR分析SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(FlankingRegion)，寻找其中的特异保守区。GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAABCABCSSR原理示意图不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。SSR的分布特点SSR分子标记的创制基因组文库的构建探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择测序引物设计检测SSR的特点：两侧顺序保守，在同种间多相同；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；实验重复性好，结果可靠；多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；仅需微量组织，适合PCR分析半自动化由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长；实际分析时一般每次只分析单个位点；不同引物退火温度不同，需要探索。不足：AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)•对限制性酶切片段的选择性扩增•基于RFLP技术和PCR技术的结合•定义由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。􀂇•AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。AFLP操作具体包括三个步骤：1.酶切--连接；2.PCR扩增，使目的序列扩增到0.5～1μg；3.电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增—预扩增和选择性扩增。AFLP操作步骤：AFLP电泳图select20polymorphismmarkersfrom256primers123123123123优点1）非常高的基因型分析效率；􀂇2）不需要标记开发成本，但是需要优化特异引物及引物组合；􀂇3）不需要基因组DNA序列信息；􀂇4）AFLP分析只需要很少量的DNA；(typically0.2to2.5μgperindividual).􀂇5）AFLP可应用于任何生物。缺点1）需要高质量的DNA，以确保酶切完全；2）从单个多态性DNA片段开发位点特异性标记相当困难；3）多数情况下采用的是同位素标记；4）在染色体上不均匀分布，AFLP标记经常在着丝粒附近区域高度聚集EST(ExpressedSequenceTags)SNP（singlenucleotidepolymophism）cSSR、cSNPDNA微阵列（Microarray）蛋白质组学•．．．．．．新型分子标记单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，即基因中的点突变。SNP优点：特异性共显性开发简单缺点：引物设计困难分子标记技术在植物遗传研究中的应用植物基因组遗传作图•利用遗传图和遗传标记可用来加速植物育种进程。•经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表现标记少，图距大，饱和度低。•分子标记技术的发展，使图谱上标记的密度越来越高。在植物遗传多样性研究上的应用•对植物种质资源遗传多样性的全面了解，对于拓宽遗传基础的育种策略十分重要。eg.贾继增等（1997）利用21条染色体上473个RFLP探针对小麦遗传多样性分析发现，小麦不同位点、不同染色体上的遗传多样性各不相同，普通小麦B基因组遗传多样性较高，而D组的遗传多样性最差。对在小麦育种中引进新的遗传变异具有一定的意义。•eg.通过288个位点上对338个一粒小麦系群AFLP指纹分析，结合种系分析，发现来源于土耳其东南部山脉的一个野生一粒小麦（T.boeoticum）群体与栽培一粒小麦（T.monococcum）遗传上最为相近，从而推断该地区为现代栽培一粒小麦的发源地（Heun等1998）。植物起源、分类和进化研究品种的DNA指纹图谱定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。特点：高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富的多态性。用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记和品种知识产权保护等。其中AFLP被推荐为指纹图谱绘制的最佳方法之一。•eg.Law等（1998）利用6个AFLP引物组合产生90多条多态性条带，建立了英国1934-1994广泛种植的55份小麦的指纹图谱。基因定位质量性状的基因定位近等基因系（NearIsogenicLines,NILs）•除了某一两个基因外，其他基因都相同的两个遗传材料，通常是经过饱和回交形成的除了目标性状有差异，其他遗传背景完全相同的两个遗传材料（品系）。基因定位质量性状的基因定位近等基因系（NearIsogenicLines,NILs）NILs几乎仅在目标性状上存有差异，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记，就极可能位于目标基因的两翼附近。利用NILs方法已定位了许多质量性状基因，eg.番茄抗病毒基因Tm-2a，番茄抗细菌病毒基因及水稻半矮杆基因Sdy等。产量、品质、成熟期等大多数重要农艺性状，均表现数量性状的遗传特点，受许多数量基因座位（QuantitativeTraitLoci,QTLs）和环境因子的共同作用。数量遗传学无法确定控制数量性状的QTLs数目，也无法确定单个QTL的遗传效应及染色体位置。分子连锁图谱的发展，可以实现对单个QTL遗传效应的追踪，从而应用于分子标记辅助选择。目前已发展了QTLs定位的多种方法。数量性状基因的定位比较基因组研究•利用相同的DNA分子标记（主要是cDNA标记和基因克隆）在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。新发现：不同物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。•eg番茄、马铃薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）；•水稻、小麦和玉米（Ahn等，1993；1994）；•小麦、大麦和黑麦（Devos等，1993）；•高粱和玉米（Pereira等，1994）；•以及大麦和水稻（Maroof等，1996）•．．．．．．•比较基因组学研究表明，不同物种之间在标记探针的同源性，拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。•