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1试剂的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。2DNA提取分为三个基本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。DNA提取的几种方法(1).浓盐法A.利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.B.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法;用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.1.动物来源的DNA的提取1.1经典提取方法酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。1.2玻璃棒缠绕法该法用盐酸肌裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个带钩的或前端为U形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸人TE中过夜，使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要求较高，但简单快速。1.3血细胞DNA的快速提取法采用非离子变性剂NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞，提取细胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。这样从血液中分离获得的DNA纯度高，能够满足各种临床检验和实验的需要。也可采用NP40和Tween-20同时作用破碎细胞膜，以避免SDS对以后步骤的负面作用。Basuni等[‘〕采用了4种常用的从血液中提取DNA的方法:HighPureViralNucleic试剂盒法、QlAamp试剂盒法、Tri-PureTM试剂分离提取法以及经典酚抽提法，对通常作抛弃处理的血凝块进行人DNA及病毒DNA的抽提，发现前两种方法可以迅速高效获得目的DNA，从而建立了由血凝块中提取DNA的方法，扩大了临床检验样本的来源。1.4玻璃颗粒吸附法在该法中首先利用含异硫氰酸肌的细胞裂解液裂解细胞，然后加人含有能够与DNA结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合染色体DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以与DNA进行结合，一定大小的硅胶颗粒也可以与DNA进行结合，据此，不少实验工作者实践了很多利用颗粒结合DNA的提取方法。Pichler等[2〕在从抹香鲸(Physetermacrocephalus)牙齿及骨骼中抽提DNA时采用了一种以二氧化硅为吸附介质的方法，从抹香鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了足够用于分析的DNA产物，此方法扩大了对稀有哺乳动物DNA研究的取材范围。Caldarelli-stefano等[3〕在从福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织标本中提取DNA时利用小磁珠作为结合核，也获得了理想的纯化DNA。很多试剂公司也依此设计生产了许多颗粒提取试剂盒，Pint。等[4]就探讨了采用Gibc。公司的GlassMAX系统，对福尔马林固定的组织进行DNA提取的具体操作方法，目前这些试剂盒在临床上广为应用，省时省力。1.5三乙醇胺月桂基硫酸盐(TLS)法由于常规方法中使用的蛋白酶K的水解条件不好掌握，采用TLS来提取组织、细胞以及外周血DNA可以克服这一弊端。TLS是一种较强的表面活性剂，将其直接作用于细胞或组织匀浆，可迅速溶解细胞膜、核膜，而且蛋白质与其结合后即失去对DNA的结合，进一步的纯化可采用常规方法。1.6临床病理标本的DNA提取方法由于PCR技术不仅可用于基因分离、核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控研究、基因病的诊断及肿瘤发生机理的探讨等。近年来，PCR技术已广泛应用于病理学研究，尤其对福尔马林固定石蜡包埋病理标本进行相关的研究更成为关注的焦点。对于从这些病理标本中提取DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，该法虽然效率较高，但费时费力，而且其操作中要求多次离心，增加了样品污染的可能性。近年来很多高效灵敏的方法在实践中得以采用，这些方法通常采用加热或微波法〔s〕去除包埋的石蜡，使用SephadexG-5。柱色谱或盐析法[s7等去除蛋白质。高文涛[71等在研究福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取方法对PCR的影响时，发现在组织切片中加人鳌合树脂(ChelatingResin，亚氨基二乙酸)提取获得的DNA可取得较好的PCR扩增结果。Coombs等〔s〕则采用热循环方法，将标本上的蜡融人样品溶液，在酶的作用下进行裂解，然后用Chelex-100进行吸附，离心去蜡，这种方法安全、简便、有效、经济。1.7盐析法该法用饱和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的DNA质量可以满足PCR模板的要求，但产率相对较低，纯度较差。谭建明等[9]对上述盐析法进行了改进，即将处理过的样本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C消化1h，然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质，并经离心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。该法简化了DNA的抽提步骤，可用于人体各种样本DNA的提取，所获DNA的纯度可以满足各种检测的需要。2植物来源的DNA提取利用基因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程操作离不开植物基因组总DNA的制备，不同植物的核酸结合蛋白的情况各不相同，因而要采取不同的提取方法[10]。由于植物中次生代谢产物—多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物DNA纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等酶类的生物活性。因此要从富含多酚和多糖的植物组织中分离获得高质量的基因组DNA也并非易事[11l。目前采用的方法有以下几种。2.1十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法CTAB是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA和多糖分开，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。在该法中使用的聚维酮(PVP)与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的DNA降解[121。王卓伟等[13〕在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVI〕还能有效地去除多糖。罗志勇等[14〕在研究中对这种方法进行了几点改进:①提高CTAB的浓度;②对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中琉基乙醇的含量，同时加人PVP使其与多酚类物质结合形成复合物;③增加低盐沉淀缓冲液的量;④增加高盐溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA,Porebski等[1s]在沉淀粗提DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5mo卜L-’以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等[16]对传统的CTAB法进行了优化，创建了一种从新鲜草本植物样本中提取DNA的方法。首先在特制的有96个孔的托盘上种植植物样本，并依照不同样本在托盘中的位置进行编号，然后取适量植物叶子分装在充满提取液的塑料袋中，除去袋中的空气并封口，再用特制的手工匀化器将各袋中的样本混匀，56`C孵育1h后将袋中的液体取出进行离心以及DNA的沉淀。Xin等〔17〕则采用简易的96孔托盘作为提取时的容器，将多种植物样本经研磨处理后分别放在不同的孔中进行提取，在一天内由一人就可完成上千个样本的DNA提取，为高通量植物基因分析及筛选提供了极大的便利。2.2SDS法为了避免CTAB法试验步骤多、操作繁琐的不足之处，近年来又提出了利用SDSTris-Cl--EDTA等直接裂解细胞使其释放出DNA的方法]。在该法后续的DNA纯化过程中通常采用酚/氯仿处理，但对于植物DNA纯化不是一个很好的选择，因为酚的使用可降低DNA的提取效率和纯度。在用该法提取DNA的过程中采用较大的离心力和较长的离心时间，然后用氯仿一异戊醇代替酚来去除变性蛋白质，从而克服了由于酚的掺人及残留对以后酶切带来的困难。用琉基乙醇代替SDS，对大豆DNA分离提取能够更有效地去除蛋白质，而且可以有效防止褐变，获得天然双链高分子量的DNA产物，并且减少了SDS对PCR、随机扩增多态性DNA技术(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)等操作的影响。在对辣椒DNA进行提取时为了提高DNA的产率将待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且针对辣椒叶子中多酚类物质极少的特点将其中的加人PVP的步骤省去，消除了PVP对以后操作的影响.2.3氯化千法在对称猴桃的基因组DNA提取过程中选用了氯化节法，与其他方法相比该法的得率较高，其原因可能是氯化节不仅可与植物细胞壁上的多糖经基反应生成醚，而且与细胞液中多糖物质的All基反应，起到破坏糖链的作用，利于DNA的释放和提纯。2.4高盐低pH法该法中所用的提纯试剂仅为无机盐和异丙醇。通常采用的无机盐为醋