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DNA杂交作为信号开关的分子识别和应用【摘要】DNA杂交作为信号开关的分子识别检测是发展成熟，应用广泛的分析策略之一。本篇课程报告列举了已经使用的五种模式，并一一以实例介绍和探讨，最后对其特点和发展方向进行了总结和讨论。【关键词】DNA杂交信号开关识别检测脱氧核糖核酸（DNA）承载了真核生物绝大多数的遗传信息任务，其精妙的螺旋分子结构，严格的碱基配对互补（即腺嘌呤A与胸腺嘧啶T以两个氢键配对，鸟嘌呤G与胞嘧啶以三个氢键配对，见图1)让人为之叹服，也吸引着、生命科学、化学、医药等诸多领域研究者的目光。在分析化学方面，DNA一方面扮演着重要的被检测物角色，一方面在构建完整信号响应过程中起到了巨大作用，而利用DNA杂交作为信号开关的分子识别就是其中发展最为成熟，应用最为广泛，模式最为多样的一种策略。分子识别是特异性过程，利用被检测物对DNA杂交状态的特异性改变，以及DNA杂交本身具有特异性的特点，就可以实现识别。识别最终要转化为检测，此时就体现了DNA杂交的信号开关作用，图1.碱基互补配对即在其杂交状态被改变后，可以触发与被检物相关联的信号变化，变化的信号被监测、记录和分析，就可得到被测物的信息。要说明的是，这里的信号开关概念不是单纯的信号有无，也可以指信号强弱的迅速改变；利用信号开关模式的检测也不仅是对被检物有无的定性，也可以实现一定范围的定量。DNA杂交作为信号开关的模式可以总结为：（1）杂交引入信号，或杂交或逆过程本身引发信号的改变；（2）通过杂交，释放信号分子；（3）DNA杂交辅助聚合；（4）有关空间距离控制的信号开关；（5）双链DNA反应。这些模式在实际应用中也互有交错。一、杂交引入或引发信号利用带标记的DNA互补链与体系中单链DNA（ssDNA）杂交，从而将信号分子引入体系，是最简单的使信号从无（关）到有（开）的方式，被标记的ssDNA可以是探针，也可以是目标链，检测物可以是DNA，也可以是与DNA连接的其它被测物；而相应的，若体系中ssDNA是带有标记的，信号为开，利用带有猝灭剂的互补链DNA杂交猝灭原有信号也是一种简单实用的方法。这种通过标记与杂交的方式实现分子识别及其后的检测早已在传统图2.染料标记目标DNA引入光电信号的光电传感器DNA芯片中得到广泛应用[1]，在其它方面也是重要的识别和检测策略。Tokadome等设计了一种检测DNA的光电传感器（见图2）。以罗丹明B或AlexaFluor647两种染料为光敏剂，标记目标DNA单链，目标DNA与连接在TiO2表面的探针DNA杂交后，在特定光照下诱发光电流，实现检测；光电流大小可以与目标DNA浓度相联系，从而为实现定量检测提供了可能[2]。ShurongTang等则利用DNA杂交引入CdS量子点（CdSQDs)，使得Pb2+的浓度与CdS的方波溶出伏安信号相关联，达到定量检测的目的（见图3）[3]。信号响应过程不仅涉及CdSQDs标记的DNA与互补链的杂交，也涉及Pb2+激活DNA酶，催化DNA断裂解旋的过程，设计非常巧妙。同时，在这个实验中作者采用滚环扩增制造大量与CdSQDs标记的短链DNA互补的序列，使得每个Pb2+对应多个CdSQDs，从而解决了杂交引入信号源时信号放大的难题。以上皆为标记的方法，而带标记的分子识别与检测过程存在诸多问题，例如用作标记的基团存在毒性，标记物易脱落，标记过程耗时长等，因此免标记技术成为了重要的发展方向。DNA杂交及解旋本身存在着质量、形态、电化学性质等变化，所以理论上任何可以检测图3.利用滚环扩增和CdSQDs标记的DNA实现Pb2+检测与信号放大相关信号的手段都可以使用，如电化学阻抗谱（EIS）[4][5]，表面共振[6]等。HuiBoonTeh等用石英晶体微天平（QCM）的方法检测Pb2+激活DNA酶，催化DNA断裂解旋后的质量减小。因为Pb2+对DNA酶的激活是特异性的，由于被剪切链DNA序列的特殊设计，酶对DNA的催化断裂位点也是特异性的，所以这个方法完成了对Pb2+的特异性识别和检测[7]。二、通过杂交，释放信号分子这是最能体现DNA开关作用的一种模式。基本原理是可用单链DNA作为封堵剂，在与互补序列结合后脱离(通常是本身折叠形成发卡结构），原先被封装的信号分子，例如荧光染料等得以释放，产生信号。图4为钱若灿等设计的一种应用于活细胞内端粒酶检测的探针。首先，荧光猝灭剂被固定于硅球孔道内壁，灌注的荧光素荧光被猝灭，呈off状态。用于封堵硅球的ssDNAO1由重复的CCCTAA序列和端粒酶引物序列构成，在癌细胞内，高度表达的端粒酶将O1末端延长出TTAGGG的序列，与CCCTAA互补，形成刚性发卡结构，O1从硅球上脱落，释放荧光素分子，脱离了猝灭剂后荧光显现，呈on状态图4.DNA荧光开关[8]。O1在分析过程中一方面起到开关作用，一方面也实现了端粒酶特异性识别。三、DNA杂交辅助聚集这是一种利用DNA杂交过程将纳米粒子聚集的策略，纳米粒子的聚集直接引发相关被检信号的形成或变化。XimeiQian等设计了表面修饰特定ssDNA的金纳米粒子（AuNPs），加入互补链后，AuNPs聚合，若通过DNA链长控制间距在10-20nm，拉曼光谱有明显增强效应，信号由弱转强。通过温度控制DNA杂交与解旋，还可实现on与off的转换[9]。Dong-KwonLim等采用DNA和Ag层厚度两个控制手段，，将信号开关过程分为DNA辅助聚集和Ag层生长两步，制备了识别和检测DNA的拉曼标签[10]。DNA杂交辅助聚集的重要应用是在活细胞内物质检测方面。通常体积小的探针更容易进细胞，因而利用DNA杂交辅助聚集，先将小的纳米粒子导入细胞，此时无信号或弱信号，再导入互补链DNA或利用胞内核酸使纳米粒子聚集，信号开，类似思路已在基于疏水作用的胞内自组装上得以体现[11]。另外，这种策略中可以同时使用DNA实现分子识别过程，识别物可以是引发聚集的DNA，也可以是能与双链DNA连接的物质。后者可以使用表面增强拉曼光谱检测，通过DNA链长的距离控制实现被检物因聚合恰好处图5.DNA的碱基距离于增强区域。四、有关空间距离控制的信号开关DNA严格具有每十个碱基构成一个3.4nm完整螺旋的特点（见图5），这一特点为构建空间距离控制的信号开关提供了可能。具有空间相关的效应除了已经举例的表面拉曼增强作用外，还有能量转移（ET）过程，例如荧光共振能量转移（FRET），激子-等离子体激元相互作用（EPI）等，这些都已有应用实例。FRET是当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离接近时，发生一种非放射性的能量转移，使得供体的荧光猝灭的作用。钱若灿将Cy5标记于长链DNA的5’端，3’端用巯基和Au的反应连接于AuNP，AuNP猝灭Cy5荧光，信号为off状态；当端粒酶延长短链（TSP），发生内部链取代，Cy5离开Au表面，荧光状态转为on（见图6）[12]。EPI与FRET有一定相似性。以CdSQDs和AgNPs光电体系为例，光激发CdSQDs伴随的发光过程，同时激发AgNPs产生表面等离子体激元(SPR)，伴随着粒子间的能量转移(ET)过程，CdSQDs的图6.内部链取代打开缺口的分子信标点亮胞内端粒酶光生电流强度将产生一定程度的降低，即所谓“猝灭”，亦为信号的关[13]。在光电体系中，例如EPI等利用DNA控制距离是一种实用易行，有十分有效的策略，光电活性物质，包括具有光电活性的DNA与电极基体的距离的控制都是较为常见的手段[14][15]，在DNA、蛋白质、有机小分子、离子等识别与检测方面有重大价值。五、双链DNA反应形成双链DNA（dsDNA）后，相比ssDNA具有不同反应，如特殊位点可被限制性核酸内切酶识别并剪切等。根据这种反应的不同，可对只与dsDNA或ssDNA的物质进行检测，也可以用这些物质构建DNA识别检测的传感器。DNA本身一般不具有光电活性，也不能传导电荷，但是掺杂氧化还原性物质可以提高其电荷传导性能，从而完成光电转换过程。Ru(bpy)2dppz2+是一种很好的掺杂剂，但是只能插入到dsDNA中，根据这一性质，XiaoruZhang等设计了一种DNA光电传感器，见图8[16]。图8.Ru(bpy)2dppz2+掺杂的DNA光电传感器图7.CdSQDs和AgNPs体系的EPI过程同样采用光电检测手段，根据某种酶对dsDNA具有弯折效应，并利用已经提及的EPI过程，可以构建此酶或DNA的传感器。具体实验还在进行中。总的来说，DNA杂交作为信号开关的分子识别具有特异性、灵敏性和多样性的特点。其特异性主要由被检测物对DNA杂交状态的特异性改变，DNA杂交本身的特异性来实现；其多样性则体现在可检测信号的多样性（带来检测手段多样性），被检测物质的多样性，实现检测的原理、策略的多样性等。虽然DNA杂交作为信号开关已经被广泛使用，但是仍具有很大的提升空间，包括新的检测原理和方法的开发，相关新材料的发展等。这有赖于对基于DNA的分子识别过程的进一步探索：结合纳米技术、自组装技术的发展，以及生命科学的进展，在分子水平上推进基础理论研究，加深对分子识别过程的理解，发现新的识别反应。另一方面，现有的实验时间都普遍偏长，一个完整的识别、检测、分析过程可能需要一天甚至更长的时间，而且检测成本非常高，导致这些技术很难应用于实际，所以除提高准确性、灵敏度外，如何提升检测速度与自动化程度，降低成本应该是一个必须要考虑的问题。此外，信号开关可以对应0/1的二进制编码，故而我们可以设想这些DNA杂交作为信号开关的策略也可以引入到DNA计算机等领域，作为一种新的计算模式。但是这个过程虽涉及分子识别，但关联性已经不大，也尚没有相关文献予以可行性佐证，所以不深入讨论。【参考文献】1、HellerRA,SchenaM.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,94,2150.2、TokadomeH.,YamadaY.,etal.Appl.Phys.Lett.,2005,87,213901.3、ShurongTang,PingTong,HengLi,JingTang,LanZhang*.Biosens.Bioelectron.,2013,12,608.4、ZhenzhenLin,YueChen,XiaohongLi*,WeihaiFang.Analyst,2011,2367.5、ZhenzhenLin,XiaohongLi,Heinz-BernhardKraatz.Anal.Chem.,2011,83,6896.6、WattsHJ,YeungD,ParkesH.Anal.Chem.,1995,67,4283.7、HuiBoonTeh,HaiyanLi,SamFongYauLi.Analyst,2014,139,5170.8、RuocanQian,LinDing*,HuangxianJu*.J.Am.Chem.Soc.,2013,135,13282.9、XimeiQian,Xizhou,ShumingNie*.J.Am.Chem.Soc.,2008,130,14934.10、Dong-KwonLim,Ki-SeokJeon,HyungMinKim,Jwa-MinNam,YungDougSuh.Nat.Mater.,2010,9,60.11、DejuYe,PanditP,etal.BioconjugateChem.,2014,25,1526.12、RuocanQian,LinDing,LiwenYan,ManfeiLin,HuangxianJu*.J.Am.Chem.Soc.,2014,136,8205.13、Wei-WeiZhao,Pei-PeiYu,YunShan,JingWang,JingJuanXu,Hong-YuanChen.Anal.Chem.,2012,84.14、EyalGolub,GiladPelossof,RonitFreeman,HongZhang,ItamarWillner*.Anal.Chem.,20