DNA生物传感器监测环境问题

细胞分子生物学课程论文年级、专业：环境科学与工程专业论文题目：DNA生物传感器的应用领域及其研究进展授课教师：考试成绩：摘要随着生物传感技术在的广泛应用，本文应势综述了DNA生物传感器的主要应用领域及研究进展。DNA传感器用于受感染微生物的核酸序列分析、微量污染物的监测以及研究污染物与DNA之间的相互作用，为污染物毒性作用的进一步研究提供理论机理。由于核酸作为敏感元素固化到传感器上作为感应层具有稳定性，易于合成和再生，故DNA生物传感器中在环境监测领域备受关注。此外，纳米技术的日臻成熟为DNA生物传感器指明了广阔的发展道路。关键词：DNA生物传感器纳米技术核酸序列分析1引言随着分子生物学和生物技术的发展，人们开发了以核酸探针为识别元件，基于核酸相互作用原理的DNA生物传感器。20世纪60-70年代，也就是生物传感器的起步阶段，当时生物传感器主要以传统的酶电极为主，随着研究的不断深入80年代到了生物传感器发展的高潮阶段并研制了介体酶电极，到90年代后，由于生物传感器的优势得以在广泛应用，传统的DNA检测主要依靠膜上分子杂交和电泳，其技术要求高，时间长，成本高，效率低。而DNA生物传感器的出现使DNA得检测大大简化。DNA序列分析为检测环境微生物和病原菌提供了基础,这种传感器可大幅度减少分析时间，简化分析手续，因此，多用来快速现场监测。核酸杂交生物传感器的理论基础是DNA碱基配对原理。因高度专一性的DNA杂交反应与高灵敏度的电化学检测器相结合，在环境生物技术领域、医疗卫生领域等发挥着举足轻重的作用。2DNA生物传感器的设计原理及分类DNA生物传感器是一种能将目标DNA的存在转变为可检测电信号的传感装置。它由辨认元件即DNA探针和换能器两部分组成。通常是在换能器上固化一条单链DNA，经过DNA分子杂交，对另一条含有互补序列的DNA进行识别，构成稳定的双链DNA，通过声、光、电信号的转换，对目标DNA进行检测。其设计原理是在电极上固定一条含有十几到上千条核苷酸的单链DNA,通过DNA分子杂交,对另一条含有互补碱基序列的DNA进行识别,结合成双链DNA（高利波等，2002）（王建龙，2000）。杂交反应在敏感元件上直接完成,换能器能将杂交过程所产生的变化转变成电信号。根据杂交前后电信号的变化量,推断出被检测的DNA量。由于杂交后的双链DNA稳定性高,在传感器上表现的物理信号(电、光、声等)都较弱,因此,有的DNA传感器还需在DNA分子之间加入嵌和剂,把分子杂交后的DNA分子含量通过换能器表达出来。因换能器和分子识别种类不同,所以就可以构成不同类型的DNA生物传感器。按换能器转换信号可以分为电化学DNA传感器、光学DNA传感器、压电晶体DNA生物传感器三类。3DNA生物传感器的应用3.1DNA生物传感器在环境监测方面的应用DNA生物传感器具有快速、灵敏、操作方便、成本低等优点，为快速、自动化检测奠定了基础。DNA生物传感器监测环境中的病原微生物时选择被监测对象的特异性DNA片段为探针，运用电化学或荧光指示剂，检测DNA的杂交信号。基因诱变剂主要是指能够引起基因变异的芳香族有机化合物和离子型自由基等，他们可能诱发癌症。Mascini课题组认为芳香氨化合物与单链DNA发生插入作用后对鸟嘌呤氧化信号产生影响，电极表面鸟嘌呤的氧化峰电流降低，而对单链DNA修饰的电极作用后氧化峰电流则升高。该课题组还对单链DNA序列进行了优化，发现芳香胺与长链DAN修饰的电极作用后电化学信号变化显著，对含3个苯环的芳香胺的灵敏性达到纳摩尔级，两个苯环的芳香胺的检测限达到微摩尔级(Pandey,1997)。同样，Wang等利用污染物与DNA在核酸修饰碳电极表面的相互作用来检测环境中的有毒物质（WangJ.1996）。他们利用双链DNA层与芳香胺之间的键合作用，设计了一种新型的亲和电化学生物传感器，用于检测芳香类化合物，检测限达到纳摩尔量级。通过对废水的测试结果与典型的基因毒性测试相比，可得出该传感器可用于实际废水的监测。ChicharroM等研究出用于环境样品的微生物检测，此类型传感器的研究包括核酸探针固定化的优化、杂交反应条件、指示剂的结合与检测等。但是，DNA分子中电荷的存在会影响杂交效率(Wang,1996)。Nielson等为解决这一因素，研究了以肽核酸作为探针的另一类传感器,肽核酸是以肽为骨架的一种新型的DNA模拟物,具有与DNA和RNA结合的高度亲和性,良好的稳定性,并能方便地固相合成.(Nielson,1991)。环境污染物对生物体具有较强的“三致效应”，其主要原因是污染物分子进入生物体内与DNA结合并对DNA造成不可修复的损伤。亦基于此，科研工作者采用DNA生物传感器研究环境污染物与DNA的作用并实现对其的检测（刘新会等，2013）。DNA内在的响应的变化还可用于检测DNA的物理损伤。近年来，分析评价DNA辐射损伤逐渐引起学者关注，Palecek等研究利用滴汞电极的级化曲线来分析紫外线对DNA的损伤（刘萍等，2011）。DNA生物传感器除用于检测外，还可用于研究污染物与DNA之间相互作用，解释不同污染物的毒性作用机理（王建龙，2001）。例DNA传感器可适时研究DNA与化学诱变剂之间反应动力学，在污染物与DNA结合相对强度方面提供有用信息。3.2DNA生物传感器在医疗卫生方面的应用DNA在疾病、病毒检测方面也得到广泛应用。Syvanen等在DNA生物传感器中，利用时间分辨荧光分析技术检测腺病毒DNA，检测限达到0.3pg（SyvanenAC,1986）,Ogert等使用瞬波光纤传感器对亲和纯化的多克隆体和单克隆抗体检测肉毒毒素A的效果作了比较。将毒素A的抗体共价结合在石英光纤表面，然后分别浸到含有毒素A和荧光TRITC的溶液中，最终发现荧光信号与样品中的毒素A成正比，因此，结合在石英光纤上的多克隆抗体取得较满意的灵敏度，但是传感器却对破伤风毒素没有反应，即使这两种毒素基因序列有一定的同源性。由此说明DNA生物传感器在病毒方面的检测具有较高的特异性。DNA生物传感器因其快速、灵敏等优势在DNA基因分析方面也得到迅速发展。靶基因的痕量分析对于疾病诊断和治疗都是很重要的，但DNA探针的灵敏度有限，因此高灵敏度检测特定DNA序列可采取一系列措施，如选择良好的杂交嵌合剂、采用修饰电极上非特性吸附等。4DNA生物传感器的优缺点与传统的核酸检测相比，DNA生物传感器的优点如下：1）可进行液相杂交检测，通过声、光、电等信号的变化，对靶物质的DNA进行定量检测。2）可进行DNA实时检测：将DNA生物传感技术与流动注射技术相结合。3）可对活体内核酸动态进行检测。4）DNA传感技术与人工神经网络技术结合，可筛选出选择性和活性更高的敏感元件，从而研制成多功能、智能的DNA传感器。5）无污染，DNA传感器不需要同位素标记，避免了有害物质的污染。但是DNA生物传感器还存在很多不足：目前DNA生物传感器的研究还处于初级阶段，虽在某些方面有突破，但灵敏度与现行的PCR技术还有很大差距。同时也会受杂质的干扰，而影响检测预期。尽管DNA传感器有不足，但随着与相关的技术结合对技术方法进行改造有很广阔的应用前景。从乐观角度来看，DNA生物传感器对环境污染物进行研究不仅可以实现环境体系中污染物含量的测定，同时也为污染物毒性评价及从分子水平揭示污染物的生物效应提供新思路。5发展前景随着纳米材料的发展，纳米科学技术同信息科学、材料科学、生命科学和环境科学等相互交叉将为这些领域的发展提供新的技术基础。近来的研究表明，纳米技术同生物医学相结合，在基因分子诊断、免疫分析、疾病治疗及分子生物学及生物工程方面将取得重要发展，而且是当今的研究前沿和发展方面。传感器是纳米微粒最具有前途的应用领域之一，纳米微粒具有大的比表面积、高活性特异性、极微小性等于传感器所要求的多功能化、微型化、高速化相对应。尤其是金纳米颗粒具有良好的光学和电子学特性，能对诸多的电化学检测有信号增强和放大作用，可作为荧光标记物外，还能作为电化学标记物，在发展DNA传感器方面有很好的应用前景。（杨云，聂立波.2006）。金颗粒可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，巯基之间形成很强的Au2S共价键，使胶体金可与生物活性组分结合，形成的探针可用于生物体系的检测中（胡瑞省，刘善堂，1999）。实验条件下，经过纳米颗粒修饰的金片对HS-DNA探针的吸附量比未经修饰的金片可提高3-5倍，同时也提高了传感器的灵敏度（杨婕，2007）。Wang等人利用电化学方法检测纳米金标记的DNA（Wang,1997），将抗生蛋白链霉素固定于磁性纳米粒子上用来固定生物素的纳米金相结合（高梅.2006），经处理后，对复合物上的纳米金进行溶解后用计时电位法进行分析，进而对待测DNA的量进行检测(李金花，胡劲波.2005)。另外，基因芯片（DNA芯片、DNA微阵列）是将半导体工业的微型制造技术与分子生物学技术结合起来，通过将大量的肽核酸或DNA固定在一块面积极小的硅片、玻片或尼龙膜上等基片构成。经典芯片与银染法结合提高检测的灵敏度，纳米金的独特性质为基因芯片的研究提供了一个方向，并取得一定进展。未来,生物传感器在环境监测领域中的发展趋势,将由单一功能向多功能发展,纳米生物传感器阵列或多种纳米生物传感器的集成,将是生物传感器的一个重要发展方向;集成多种技术,以提高监测效率,如碳纳米管技术（张玉忠，2011）与酶生物传感器的结合,提高了生物传感器的灵敏度并且结构简单、易于微型化、可批量生产,显示出了新型生物传感器优异的性能和巨大的生命力,进一步拓宽了在环境监测中的应用;加速从试验阶段走向商品化,向微型化、集成化、智能化方向发展（焦奎等，2010）。参考文献·焦奎，杨婕等.纳米金在DNA生物传感器和基因芯片研究中的应用[J].化学研究与应用,2007,19(3):234.·刘萍等.DNA生物传感器研究综述[J].2011,25(2):·PandeyP,WeetallH.DetectionofaromaticcompoundsbasedonDNAintercalationusinganevanescentwavebiosensor.AnalChem,1995,67(4):787-792.·高利波，俞乃胜.DNA生物传感器在疾病检测中的研究进展和应用前景[J].2002,24(1):70-71.·王建龙，张悦等.DNA生物传感器在疾病检测中的研究进展和应用前景[J].生物技术通报，2000，（3）:13-14.·王建龙.DNA生物传感器在环境污染监测中的应用[J].生物化学与生物物理进展，2001，28（1）：125-128.·WangJ,ChicharroM,RivasG,etal.NarasalahDonthaPercioAMFariasandHarukiShirashiAnal[J].Anal.Chem,1996,68(13):2251-2254.·梁刚，刘新会等.电化学DNA生物传感器在检测环境有机污染物中的应用[J].环境化学，2013，32（7）：1388-1393.·NielsonP,EgholmM,BergR,etal.Sequence-selectiverecognitionofDNAbystranddisplacementwithathymine-substitutedpolyamide.science,1991,254(8):1497-1500·焦奎，周娜等.多壁碳纳米管/纳米Ag-TiO2膜DNA电化学生物传感器[R].2010,38(3):302-304.·李泽全，张怀等.基于碳纳米管的生物传感器研究进展[J].材料导报，2008，22（8）：101-103.·李妍等.基于环境污染的生物传感器[J].环境研究与监测，2010，（4）：78-79.·WangJ.DNAelectrochemicalbiosensorforenyironmental;menitoring.Anal.Chim.Acta.,1997,347:1.·胡瑞省,刘善堂.