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实验五DNA的限制性酶切和琼脂糖电泳一、实验目的掌握DNA的限制性酶切的基本原理和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术二、实验原理1、DNA的限制性酶切限制性内切酶是基因操作中不可缺少的工具酶，它能够识别双链DNA的特定位点并切开DNA，这个特定位点是一段具有旋转对称结构的DNA片段。。绝大多数的限制酶识别长度为4~8个核苷酸且呈二重对称的特异序列。EcoRI的识别序列是G↓AATTC，BmHI的识别序列是G↓GATCC，HindIII的识别序列是A↓AGCTT。每种限制性内切酶都有特定的反应条件，如特定的pH范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。一般温度37℃，pH7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有Tris、NaCl、MgCl2，和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。典型的反应体系中包括lμg或更少的DNA和1单位酶以及合适的反应介质。反应总体积通常控制在20和50μ之间，反应时间在1小时，而反应的终止则由EDTA溶液的加入完成，因为它能鳌合核酸酶活性所必需的金属离子。2、DNA的琼脂糖电泳DNA的电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳，它们是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。琼脂糖凝胶对DNA的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。而分离小片段DNA（5~500bp）则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其分辨力极高，能分离相差1bp的片段。电泳过程中或电泳完毕直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙啶）进行染色，EB是一种丫啶类染料，其分子呈扁平形，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。即可确定DNA条带在凝胶中的位置，而且灵敏度相当高，少至1~10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。试剂（1）1×TBE电泳缓冲液：45mmol/Ltris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0（2）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。（3）λ-DNA和提取的DNAλ-DNA是λ噬菌体的基因组DNA，全长50kb。用HindIII或（和）BamHI酶切得到的片段被广泛用于DNA电泳的分子量标准。（4）分子量标准（λ-DNA/HinDIII）（5）限制性内切酶。操作方法1、DNA的限制性酶切取1只0.5mL离心管，按下列顺序加入：DNA5uL10×buffer2uL蒸馏水12uL限制酶1uL（2）轻轻摇匀，置于37℃保温1小时。（3）加入4uL加样缓冲液，摇匀。（4）取10uL进行电泳2、DNA的琼脂糖凝胶电泳（1）将电泳槽彻底洗净。（2）将电泳槽置于平整的台面上并调节水平。（3）用2%琼脂糖封固胶模边缘，任其凝固。（4）配制1×TBE电泳缓冲液。（5）用1×TBE电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使之溶解。（6）待琼脂糖溶液冷至60℃时，缓缓倒入胶模，厚约0.5mm。（7）立即插入梳子，静待琼脂糖凝固。（8）去掉封固的有机玻璃封条，将胶模放进电泳槽。（9）向电泳槽倒入1×TBE电泳缓冲液，没过凝胶5mm。（10）小心地拔掉梳子。（11）用20uL的枪吸取DNA溶液，缓缓注入点样孔。（12）按marker、限制酶酶切的DNA、提取的DNA依次点样（13）接通电源，电泳。（14）电泳完毕，取出胶模，将胶置入EB染色液中染色10min。（15）用搓板取出胶，置于紫外灯下观察。3、结果记录与分析绘出电泳图谱或照相，如果可能的话，作出分子量与迁移率的关系图。思考题1、加样缓冲液的作用是什么？2、琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和适用范围有什么异同？