DNA粗提取与鉴定实验.

DNA粗提取与鉴定实验内容课题分析1实验操作原理5材料器具3实验理论基础4教学建议2实验步骤6一、课题分析1.教学目标•（1）分析DNA的性质及提取的基本思路。•（2）探究不同手段提取DNA的实验过程。•（3）掌握DNA提取的过程并灵活运用。2.背景描述•生物体的性状之所以能够遗传给后代，是由于其体内具有DNA或RNA这些遗传物质，DNA是遗传物质已经通过实验证实。•那么DNA究竟什么样？•本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的理化性质，理解DNA提取以及鉴定的原理，在一定层面感性认知DNA。一、课题分析DNA脱氧核苷酸腺嘌呤一、课题分析dAMPdTMPdCMPdGMP胸腺嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤核苷酸结构一、课题分析脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。一、课题分析读取密码的过程称为转录。是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA（信使RNA）的核酸分子。多数RNA带有合成蛋白质的讯息，另有一些本身就拥有特殊功能，例如rRNA、snRNA与siRNA。一、课题分析在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。人正常的人体细胞中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。一、课题分析DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。洋葱内表皮细胞DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色二、教学建议科学的探究一般过程为“发现问题—提出假设—设计实验—预测结果—得出结论”。通过本实验的设计的具体的实施，是学员能够接受科学的训练，在训练过程中举一反三，从理论到实践认知DNA的提取过程和操作原理。从DNA的物质组成，到DNA的复制时期，联系生物学现象。在理解DNA的理化性质的基础上，利用其理化性质对DNA进行分离。三、材料器具材料：新鲜菠菜4kg。试剂：氯化钠1000g、SDS500g、无水乙醇4000ml、二苯胺200ml。器材：200ml烧杯60个、试管100支、研钵30个、玻璃棒30个、纱布2包、不锈钢药勺30个、滤纸5包。仪器：天平2台、水浴锅2个、漏斗30个。DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度。DNA对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起DNA分子变性，即使得DNA双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。四、实验理论基础1、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性•蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响；•大多数蛋白质不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性；•洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响。四、实验理论基础2、DNA的溶解度•DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。四、实验理论基础3、DNA在酒精溶液中的溶解性•DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。1、实验材料的选取•凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，更具有操作性，根据实验目的选取适当的材料和方法。•鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。五、实验操作原理2、细胞破碎动物细胞：没有细胞壁破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。原理：蒸馏水对于细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。植物细胞：需要先用一定的洗涤剂和氯化钠溶解细胞膜，洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放，氯化钠有利于DNA的溶解。研磨：使DNA充分释放，洗涤剂等更容易充分接触细胞膜。用液氮研磨可有效的防止DNA降解。五、实验操作原理2、细胞破碎DNA降解的原因：•温度：高温,易加速磷酸二酯键的水解。•湿度：参与磷酸二酯键的水解、影响DNA螺旋的形成结构。•pH值：氢离子参与与催化磷酸二酯键的水解、过高或过低的pH值都易破坏氢键。•氧化反应：氧化碱基中的含氮杂环,使其变性,从而进一步改变一级与二级的DNA构象。•DNA降解酶：水解DNA。五、实验操作原理3、DNA的纯化•细胞破碎后主要含有蛋白、多糖和RNA等杂质。可根据DNA的性质进行纯化。首先可通过过滤、离心等方法去除不溶解的杂质，然后再进一步纯化。•氯化钠中的溶解度，氯化钠浓度为2mol/l时DNA溶解度最大，可在此浓度下先溶解DNA，然后过滤去除不溶解的杂质，然后在DNA溶解度最低的氯化钠溶液中（0.14mol/l）使DNA析出，再过滤去除溶解在氯化钠溶液中的杂质。五、实验操作原理3、DNA的纯化•利用蛋白酶降解蛋白质，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶K等，降解蛋白质。•适当温度降解蛋白质，65-70℃，DNA不会被变性，蛋白会变性。•不溶于水的有机溶剂，酚、氯仿等，DNA不溶于这类试剂，蛋白质可溶解在其中，通过静止或离心使有机试剂和水分离，去除杂质。•DNA结合柱，硝酸纤维素膜等，在酸性条件下可结合DNA，中性和碱性条件下结合能力差。通过DNA的等电点调节其所带电荷为正电或负电，通过孔径去除大分子和小分子。五、实验操作原理4、DNA的析出•溶于水的有机溶剂可使DNA析出，水更容易和有机试剂结合，使DNA析出，如一定浓度乙醇、异丙醇（乙醇浓度一般在48-67.5%，异丙醇浓度在36%以上，浓度越高效果越好），低温效果更好（杂质较多），同时，可在一定程度上出去溶于该有机试剂的杂质。5、DNA的溶解•一般采用TE（Tris-EDTA，pH8.0）缓冲液或去离子水。五、实验操作原理6、DNA的鉴定•DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色；•可被甲基绿染成绿色；•DNA对紫外线（260nm）有吸收作用；•DNA可与溴化乙锭（EB）花青素类染料结合，可在紫外光下激发荧光。五、实验操作原理1.植物材料的研磨：称取新鲜植物材料（菠菜）100g，表面清洗后，在研钵中充分研磨，可加入石英砂，将植物组织充分研磨（可加入适量的提取缓冲液）。2.将研磨好的样品取出置于200ml烧杯中，加入100ml10%的SDS轻轻混匀，65℃水浴10-15min后取出。3.用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。4.用20mL2mol/L的NaCl溶液，溶解粘稠物，在20mL烧杯中轻缓搅拌3min，使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。六、实验步骤5.用放有两层纱布的漏斗过滤，滤液中含有DNA。6.向滤液中加入等体积的无水乙醇（或95%的乙醇），用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。7.在试管中先加入2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。六、实验步骤