DNA纳米技术从试管走向细胞的历程

DNA纳米技术从试管走向细胞的历程基于沃森-克里克碱基互补配对原则，随着合成成本的降低，DNA在构建自组装分子结构和动态分子装置上得到了广泛的应用。在无细胞环境中，DNA纳米技术的研究者对DNA复杂系统和定量反应机制的研究已经达到基因工程和细胞技术无法企及的程度。然而，DNA纳米技术最有趣的应用（最大地利用DNA系统尺寸小、生物相容性好以及可塑性强的性质）都停留在生物界面的程度。这篇综述里，我们回顾了DNA纳米技术研究从试管到细胞的历程。我们着重介绍了DNA成像探针、智能治疗及药物转运系统发展过程中的关键性突破，同时展望了细胞DNA纳米技术未来的挑战和机遇。DNA纳米技术属于纯粹的分子生物工程学技术。这一领域旨在将DNA作为工程学材料构建分子结构和装置。DNA碱基互补配对的自然特性使得控制DNA间的相互作用变得简单，同时可以合理地设计具有精确尺寸的DNA纳米结构、自主移动的分子马达和处理信息的DNA回路。目前还没有任何其它分子工程技术可以像DNA纳米技术这样完全从头设计复杂多样的类分子生物系统。DNA纳米技术的成功源于三个关键因素：1.对DNA热动力学的认知使得我们可以精确预测单链DNA自身折叠及DNA分子间的相互作用（1，2）；2.DNA合成成本不断下降，质量不断提高（3）；3.研究主要在无细胞环境中进行，DNA不会受到的DNA/RNA酶以及细胞内可能会出现的其它复杂因子的干扰，故而可以朝着设计的预期发展。长期以来，DNA纳米技术的发展动力是构建智能治疗剂、药物转运系统、分子生物学工具以及其他可以与活细胞相互作用甚至能操控活细胞的装置（4-7）（Fig.1）。这些应用是核酸结构和装置的显著优势，特别是它们尺寸小、生物相容性好以及可控的通过杂交与细胞核酸作用的明确性质。然而，要实现DNA纳米技术的应用，必须解决从高度混合的反应缓冲液到空间结构化、内容复杂的细胞环境中，实验依然可以进行（Box1）。在这篇综述里，我们总结了最近将DNA纳米技术应用至细胞的研究进程。我们着重于核酸纳米装置及结构的合理设计、化学修饰，然后转运至哺乳细胞的过程。首先，我们简单回顾了细胞外DNA纳米技术的研究；然后，转向更多的类细胞环境的研究。在细胞裂解液或固定细胞等类细胞环境下，可以不完全的部分模拟复杂的细胞环境，获得相关数据。接下来，在介绍转运DNA装置至细胞内的相关工作前，我们讨论了最近一些证明DNA纳米装置可控的与细胞表面蛋白相互作用的研究成果。紧接着介绍了在活细胞内工作的装置，同时回顾了利用DNA探针和逻辑门检测、分析和调控细胞内RNA水平的早期工作。我们通过着重介绍在活细胞内增强DNA装置表现的RNA成像探针、siRNAs或者ASOs的设计原则来介绍这一部分工作。最后，我们介绍了与DNA纳米技术很大程度上有着相同目标但又用于遗传编码和转录RNA的RNA纳米技术和RNA合成学。Figure1|DNA纳米技术在生物界面上的应用A，智能治疗剂可以将结构与分子逻辑结合，在特定的细胞或组织内实现靶标治疗（60）。B，DNA纳米结构可作为可设计的脚手架来附着药物、靶标链和脂双分子层等其他修饰（78）。C，一系列新奇的敏感特定的成像探针，基于DNA设计的与RNA序列特异性相互作用的信号放大器（52）。D，DNA折纸和其它结构可精确控制功能分子基团的空间结构，形成高效的细胞生物学定量检测工具（66）。无细胞DNA纳米技术为了在复杂潮湿的环境中可靠地实现功能，在活体用分子传感器检测环境变化；用分子马达和致动器适应环境；用计算控制回路将传感器信息转换为马达的运行；用特定结构的元素来保护并组织这些部件。有趣的是，在无细胞环境下，DNA纳米技术在组织大部分模拟复杂生物现象的分子马达必须的大部分功能化组件上已经有了一定的进展。我们在这里回顾了一些无细胞DNA纳米技术的主要成果并指出了其在细胞环境中的潜在应用。结构DNA纳米技术在上世纪80年代，NadrianSeeman提出了DNA可以作为结构工程学材料这一概念（8-10）。在1998年，Winfree等首次经实验实现了大尺寸结构的合成：他们证明纳米尺寸的DNA小块可以通过多条寡聚核苷酸链自组装形成微米级的周期性排列的DNA阵列（11）。随后，tile自组装和相关技术被成功的应用与构建一系列的阵列和网络DNA结构（11-19）。Rothemund通过DNA折纸将结构DNA自组装进一步发展。DNA折纸术操作简单，结构具有足够的弹性来适应几乎所有的二维结构，而且能够稳定高效的形成目标结构（20）。DNA折纸通过长单链与大量短订书链杂交折叠成目的结构。这项技术被快速广泛地应用，而且广泛的用于自组装三维结构（21-24）。DNA纳米结构一开始是作为药物转运工具和相似的应用来研究，因为DNA折纸上精确分布的脚手链，可以连接药物和靶标等官能基团。另外，三维结构可以设计成需载运药物的保护结构。动态DNA纳米技术动态DNA纳米技术通过DNA酶催化或DNA链置换反应介导的链杂交实现的自组装构建具有可移动部件或时变行为的装置。动态DNA纳米技术可追溯至多方面的起源，包括Adleman关于DNA计算及功能化核酸的进展和表征研究（25）。然而，真正开启这一领域的是Yurke及其合作者，他们证明功能化分子马达可被合理地设计，并且仅通过杂交和链置换反应实现周期性工作（26）。随后，Winfree和Pierce课题组证明多重链置换反应可以组合在一起构建复杂的级联反应（27，28）。由于DNA链置换级联反应原理简单，自从被应用以来已经被广泛和有效地应用于分子工程，成为大量动态DNA装置的工作原理。动态DNA纳米技术在分子马达中的应用（29，30）包括：沿轨道自主移动的步行马达（31-34）；分析复杂混合分子体系中信息的分子回路（27，35-39）；可以检测和放大信号的催化放大器（40-44）。很多这种系统有明显的潜在生物学应用，比如：Shapiro及其合作者利用DNA和限制酶构建通体外过检测和分析一类基因调控类似产物的分子标签来诊断疾病阶段（6，45）。相反的，分子装置和结构在活细胞上和活细胞内分析和检测分子信息这一应用领域超越相应的电力学方法。Box1|细胞内的人工核酸研究人员在研究ASO、siRNA、分子信标以及相关技术的过程中发展了不同的技术、设计原则及限制因素，帮助我们认识核酸纳米结构进入细胞所需克服的困难。转运在试管中，各种组分的浓度可以精确控制，实时监测反应动力学数据。核酸装置要在细胞内发挥功能，首先必须穿过细胞膜。不同的核酸转运方法会导致截然不同的细胞摄取速率、摄取量、细胞器内的分布甚至细胞状态。例如通常用于转染的脂类试剂能够有效的转运大量的探针进入细胞，但是一大部分都被包裹在溶酶体内，并不能进入细胞质（132，133）。相反，显微注射可以将核酸直接递送至细胞质或细胞核，但仅限于相关的少数细胞。我们参考了Bao等（134）更深入地比较转运合成核酸至细胞的不同方法及Davis等关于纳米颗粒药物载运的综述（85）。稳定性与化学修饰未作化学修饰的短链核酸在细胞内的半衰期很短（135）。然而，大量针对核酸五碳糖、碱基和骨架的化学修饰已被证明能够有效的增强其稳定性。最常用的修饰有核苷内连接处的磷酸化修饰和核糖的2‘甲氧基修饰（136）。因为化学修饰能有效保护核酸抵抗核酸酶的降解，一些化学修饰（比如磷酸化键合（137））可能会影响细胞活性（138）。因此，在选择核酸装置修饰时，必须平衡装置稳定性与细胞活性。分子聚集与细胞区域化细胞内密布着蛋白和其它生物大分子，会干扰多级多输入逻辑回路和其它具有很多相互作用组分系统的运行。随着分子尺寸的变化，合成DNA在细胞质内的扩散率为水溶液中1-20%（139）。在细胞环境和缓冲液中，单链互补核酸的杂交速度也不一样（140）。另外，哺乳动物细胞由多种不同的单元组合形成，这些单元间的分隔会阻碍回路中的不同组分在细胞内相遇。免疫活性进入细胞的外源核酸会通过激活TLR受体引发自发免疫应答。TLR3识别双链RNA，TLR7和TLR8识别单链RNA，TLR9识别DNA中的非甲基化CpG。哺乳细胞基因组中的CpG是完全甲基化的，而细菌的没有，TLR9的任务就是检测细胞内的细菌源的非甲基化CpG（79）。蛋白激酶R结合的长于30bp的双链RNA会激活细胞免疫应答，导致细胞死亡（141）。TLR9（142）或PKR（143）激活介导的免疫应答被认为是具有治疗意义的，所以这两种通路的免疫刺激可能是大家喜闻乐见的。然而，避免这些免疫刺激更为普遍。细胞裂解液和固定细胞内的DNA纳米技术细胞环境与无细胞环境截然不同（Box1）：DNA酶和RNA酶等核酸结合蛋白的存在可能会影响装置的功能。另外，细胞内高度结构化，限制了外源核酸的自由扩散。细胞裂解液、血清和固定细胞提供模拟活细胞某些性质的反应环境，同时有保证了DNA装置的检测和观察处于一个相对可控的环境中。DNA纳米结构在细胞裂解液和血清中的稳定性裂解液是细胞内容物的均匀混合物。即使DNA纳米结构在裂解液中遇到的细胞组分与细胞内的浓度与活性不同，核酸装置可以很容易进入这种模拟细胞内环境的没有细胞壁的环境中。YanHao,Meldrum和合作者发现DNA折纸细胞裂解液中孵育12小时后可以重新提取并表征（46），而长单链和双链孵育后无法重新获得。由于折纸与裂解液混合液的详细条件并没有公布，很难判断该反应条件与生理环境的相似度。另外，DNA折纸实在高Mg2+浓度（~10Mm）的溶液中折叠的，向裂解液中加入大量的结构会提高反应液的Mg2+浓度，使得结构看上去很稳定，但是在细胞内就很难预测了。即使这样，这些效应都是可以控制的，细胞裂解液仍然是探索纳米装置在生理环境表现的有效方法。将纳米结构送入细胞和动物要求结构在血清和含血清的培养基中能保持结构稳定。血清跟裂解液一样含有核酸酶，缺乏维持结构所需的镁等盐离子。Conway等发现具有三棱柱结构的三链小结构血清内稳定性比无结构混合链好（47）。电泳分析显示无结构链在10%胚牛血清中的半衰期小于1小时，而具有完整结构的链半衰期接近两小时。对链进行化学修饰后，结构的半衰期甚至大于24小时。Perrault和同事全面分析了三维折纸在含血清的哺乳动物细胞培养基内的稳定性，证明折纸结构稳定性的强弱取决于：折纸的设计、Mg2+浓度及核酸酶的活性（48）。通过电泳和TEM表征，他们发现折纸与细胞培养基孵育一天后，3次试验中有两次出现了部分折纸分解的现象，而向培养基中加入6mMMg2+可以抑制分解。有趣的是具有三级结构的DNA折纸纳米管即使不在培养基中加盐也能保持结构稳定。向培养基中加入高于5%的胚牛血清，孵育24小时后3种结构皆被DNA酶部分降解。当加入能与核酸竞争性结合的肌动蛋白后核酸酶对结构的降解作用神奇地减弱了，并且这种修饰在细胞培养环境下也有效。为了定量DNA酶对纳米结构降解的程度，Keum和Bermudez检测了DNA四面体在DNAase1存在下的半衰期，发现DNA四面体比双链DNA稳定3倍（49）。DNA折纸也同样被证明在核酸酶的环境中比双链DNA稳定。Castro等将折纸与不同的核酸酶孵育24小时后，通过TEM和电泳评估折纸的降解程度（50）。在DNase1和T7核酸内切酶环境中检测到了降解，然而在DNase1中折纸的降解速度比DNA双链慢了几百倍。比较折纸与四面体的研究，证明DNA折纸比较小的四面体更稳定，可能是应为折纸中链之间的连接更紧密。上述的研究说明DNA纳米结构比简单的单双链核酸更能抵抗核酸酶的降解。而且一些纳米结构在生理盐浓度下能够长时间保持结构的完整。以后的研究必需完全揭示结构的功能与稳定性的内在关系。固定细胞内的DNA纳米技术通透化处理的细胞和组织在某些方面依然能够模拟细胞环境：固定化细胞的很多结构组织依然保存完好，特别是区域化分布的mRNA和蛋白。固定化细胞为免疫或荧光原位杂交观测细胞内的mRNA和蛋白分布提供了一个可控的环境。基于DNA纳米结构的新方法很实用并且提高免疫或荧光原位杂交的灵敏度和特异性。例如基于HCR的分