搜索
EGFP在E.coli中的表达与检测3组一二三四五背景介绍实验流程实验步骤预期结果参考文献contents第几章一、背景介绍1、绿色荧光蛋白（GFP）2、质粒3、大肠杆菌表达载体及表达系统4、SDS-PAGE原理及蛋白分离与检测一1-绿色荧光蛋白1.1发现下村修马丁-查尔菲钱学健发现GFP发光的遗传标签科研一1-绿色荧光蛋白（GFP）1.1发现GFP的分子质量为26kDa，晶体结构如左图所示。蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从该螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65～67位的“丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸”自身环化和氧化形成。一1-绿色荧光蛋白（GFP）1.2特性一GFP在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395nm，另一小吸收峰为470nm，最大发射峰为505nm。1-绿色荧光蛋白1.2特性一1-绿色荧光蛋白1.2特性优点：易于检测，荧光稳定，无毒害，通用性，易于构建载体，活细胞观察一1-绿色荧光蛋白1.3应用生物学研究生态学研究医学研究一2-质粒2.1pEGFP-N3质粒一2-质粒2.1.1pEGFP-N3质粒描述pEGFP-N3encodesared-shiftedvariantofwild-typeGFP(1–3)whichhasbeenoptimizedforbrighterfluorescenceandhigherexpressioninmammaliancells.(Excitationmaximum=488nm;emissionmaximum=507nm.)pEGFP-N3encodestheGFPmut1variant(4)whichcontainsthedouble-amino-acidsubstitutionofPhe-64toLeuandSer-65toThr.ThecodingsequenceoftheEGFPgenecontainsmorethan190silentbasechangeswhichcorrespondtohumancodon-usagepreferences(5).SequencesflankingEGFPhavebeenconvertedtoaKozakconsensustranslationinitiationsite(6)tofurtherincreasethetranslationefficiencyineukaryoticcells.TheMCSinpEGFP-N3isbetweentheimmediateearlypromoterofCMV(PCMVIE)andtheEGFPcodingsequences.GenesclonedintotheMCSwillbeexpressedasfusionstotheNterminusofEGFPiftheyareinthesamereadingframeasEGFPandtherearenointerveningstopcodons.SV40polyadenylationsignalsdownstreamoftheEGFPgenedirectproperprocessingofthe3'endoftheEGFPmRNA.ThevectorbackbonealsocontainsanSV40originforreplicationinmammaliancellsexpressingtheSV40T-antigen.Aneomycinresistancecassette(Neor),consistingoftheSV40earlypromoter,theneomycin/kanamycinresistancegeneofTn5,andpolyadenylationsignalsfromtheHerpessimplexvirusthymidinekinase(HSVTK)gene,allowsstablytransfectedeukaryoticcellstobeselectedusingG418.AbacterialpromoterupstreamofthiscassetteexpresseskanamycinresistanceinE.coli.ThepEGFP-N3backbonealsoprovidesapUCoriginofreplicationforpropagationinE.coliandanf1originforsingle-strandedDNAproduction.一2-质粒2.1.2pEGFP-N3质粒应用FusionstotheNterminusofEGFPretainthefluorescentpropertiesofthenativeproteinallowingthelocalizationofthefusionproteininvivo.ThetargetgeneshouldbeclonedintopEGFP-N3sothatitisinframewiththeEGFPcodingsequences,withnointerveningin-framestopcodons.TheinsertedgeneshouldincludetheinitiatingATGcodon.TherecombinantEGFPvectorcanbetransfectedintomammaliancellsusinganystandardtransfectionmethod.Ifrequired,stabletransformantscanbeselectedusingG418(7).pEGFP-N3canalsobeusedsimplytoexpressEGFPinacelllineofinterest(e.g.,asatransfectionmarker).一2-质粒2.1.3pEGFP-N3质粒图谱675bp～1394bppEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码GFPmut1突变体，发生了两个氨基酸的替换。一2-质粒2.1.4pEGFP-N3的EGFPLeuPhe-64Ser-65Thr荧光强度增加了35倍一2-质粒2.1.5编码EGFP的基因片段675～1394bp长度720bp651GCGGGCCCGGGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT700701CACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCC750751ACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG800801CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCC850851CACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC900901CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC950951TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGAC10001001CCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGC10501051TGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG11001101GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAA11501151GAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA12001201GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC12501251CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAG13001301CAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA13501351CCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGC14001401CGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTT1450一2-质粒2.2pET28a质粒一2-质粒2.2.1pET28a质粒描述ThepET-28a-c(+)vectorscarryanN-terminalHis•Tag®/thrombin/T7•Tag®configurationplusanoptionalC-terminalHis•Tagsequence.Uniquesitesareshownonthecirclemap.NotethatthesequenceisnumberedbythepBR322convention,sotheT7expressionregionisreversedonthecircularmap.Thecloning/expressionregionofthecodingstrandtranscribedbyT7RNApolymeraseisshownbelow.Thef1originisorientedsothatinfectionwithhelperphagewillproducevirionscontainingsingle-strandedDNAthatcorrespondstothecodingstrand.Therefore,singlestrandedsequencingshouldbeperformedusingtheT7terminatorprimer(Cat.No.69337-3).一2-质粒2.2.2pET28a质粒图谱卡那霉素抗性一2-质粒2.2.2pET28a质粒图谱一3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.1表达系统常见的大肠杆菌表达系统如下：①T7表达系统：T7噬菌体RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的35倍②Lac表达系统是β-半乳糖甘酶编码基因lacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种很强的启动子一个完整的大肠杆菌表达系统至少要由表达载体和宿主菌两部分构成。一3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.2大肠杆菌表达体系大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：——易于生长和控制；——用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；——有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。——在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：一3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.3原核表达载体选择标志的编码序列可控转录的启动子转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)一个多限制酶切位点接头宿主体内自主复制的序列一3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统宿主菌载体筛选启动子融合标签BL21(DE3)pET28a卡那霉素T7lacHis-TagT7--Tag表达系统一3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统——菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为