EMSA的具体实验方法(frombioon)

1.探针的标记：(1)如下设置探针标记的反应体系：待标记探针(1.75pmol/微升)2微升T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)1微升Nuclease-FreeWater5微升[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmolat10mCi/ml)1微升T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)1微升总体积10微升按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4PolynucleotideKinase，混匀。(2)使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。(3)加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。(4)再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。(5)标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。2。.探针的纯化：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：(1)对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。(2)在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。(3)在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。(4)在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。(5)加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。3。EMSA胶的配制：(1)准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。(2)按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。TBEbuffer(10X)1毫升重蒸水16.2毫升39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)2毫升80%甘油625微升10%过硫酸铵(ammoniumpersulfate)150微升TEMED10微升(3)按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。4。EMSA结合反应：(1)如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：阴性对照反应：Nuclease-FreeWater7微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子0微升标记好的探针1微升总体积10微升样品反应：Nuclease-FreeWater5微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升标记好的探针1微升总体积10微升探针冷竞争反应：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升未标记的探针1微升标记好的探针1微升总体积10微升突变探针的冷竞争反应：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升未标记的突变探针1微升标记好的探针1微升总体积10微升Super-shift反应：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升目的蛋白特异抗体1微升标记好的探针1微升总体积10微升(2)按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。5。电泳分析：(1)用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。(2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。(3)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。(4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。(5)干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。