EMS在作物育种应用中的研究进展

EMS在作物育种应用中的研究进展甲基磺酸乙酯(简称EMS),是一种改变DNA结构烷化剂,对生物系统作用的重点主要是核酸,对修复酶的钝化也有一定的作用,它与DNA中的磷酸嘌呤、嘧啶作用,使之突变。烷化剂甲基磺酸乙酯为植物最有效的化学诱变剂之一,自从1953年,KLMARK首次报告了EMS对突变诱导的有效性以来,目前已被广泛应用于农作物诱变育种,现已育成了2250个品种,主要有水稻、小麦、大麦和大豆.二、水稻类病斑突变体的初步研究根据类病斑出现的生长阶段,通常将类病斑突变体分为全生育期型、营养生长阶段起始型和生殖生长阶段起始型3种。四、水稻斑点叶变异研究进展可遗传的变异是水稻进化的基础,通过变异水稻发生一系列肉眼可见或不可见的变化。水稻斑点叶(spottedleaf)属于肉眼可见的叶片形态变异,发生变异的叶片上产生色泽、形状和大小不同的斑点,在有些突变体中斑点还会出现在叶鞘、枝梗和谷壳。这种斑点的发生是在没有明显逆境、机械和农药损伤或者病原菌侵染的条件下,由植物体自发形成的,大多数情况下与无毒病原菌侵染时产生的病斑相似。由于斑点的颜色多为褐色,类似于水稻胡麻斑病和稻瘟病,许多学者又称之为类病变或类病斑(lesionmimic,lesionsimulatingdisease)。之所以划分为起始型和扩散型两类,是因为认为植物中存在激发和抑制程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)两种途径。很多时候斑点叶突变体又被称为类病斑突变体(lesionmimicmutant),因为他们共同的特征是斑点部位的细胞坏死,这种坏死斑与植物过敏性反应(hypersensitiveresponse,HR)形成的病斑非常相似。有些突变体的斑点受到温度和光照等环境因子的影响,例如,水稻突变体spl7的斑点在高温和太阳光下表达,而Oslsd1在低温和短日照条件下表达。这种现象在水稻和其他植物中还有许多报道。说明有些斑点叶基因参与光温调节的代谢途径,可能与植物的光合作用以及耐逆境有关。除了产生斑点以外,许多突变体还伴随其他农艺性状的改变,包括株高、育性、分蘖力和产量等。水稻突变体sl、cdr1和spl5均为矮化植株，spl3和spl4部分不育,产量下降，spl19叶片变窄、卷曲以及结实率降低。我们观察到水稻斑点叶突变体HM42除表现矮秆以外,还伴随育性降低和分蘖力严重下降(未发表数据)。此外,有些斑点叶突变是致死的,突变体无法完成整个生命周期;还有些突变体是纯合致死的,只能通过杂合体保存。可见斑点叶基因作用广泛,几乎涉及植物的生长、发育、衰老和死亡等所有生理生化过程。并非所有的斑点叶突变体都能形成坏死斑(necroticlesion),但其中有一类突变体能在无任何外界因子的作用下产生类似病原菌侵染时的过敏性反应(HR),局部形成坏死斑,即所谓的类病斑突变体。与HR相似,类病斑处的细胞坏死,同属程序性细胞死亡,而程序性细胞死亡(PCD)在植物生长发育、衰老和保持健康中起重要作用,因此,类病斑突变体成为科学家对PCD机理研究和认知的理想材料之一。可稳定遗传的水稻斑点叶突变体均遵守孟德尔遗传规律。绝大多数突变体受单隐性基因控制,也有不少受单显性基因控制的情况,个别突变体受到2个隐性基因控制。有的突变体是母体遗传的。AP1M1在原核与真核生物中高度保守,但到底与衰老有何关系却鲜有报道HR是研究得最多的一种程序性细胞死亡,绝大多数斑点叶突变体也都有类HR特征,部分细胞死亡的知识就是来源于对这类突变体的研究。但植物如何调控HR,如何将细胞死亡限制于被病原菌侵染的部位,而不至于扩散到周围正常的细胞中,从而避免PCD失去控制,这仍然是个谜。可见斑点叶突变体的遗传模式虽不复杂,但斑点形成的机制却相当复杂,不仅与植物防卫反应有关,还与叶绿素代谢、脂肪酸代谢、耐逆境胁迫以及解毒作用等途径有关。确定相关的酶、蛋白和化合物在PCD中的因果关系,是阐明PCD的关键环节之一。目前已经发现一些化合物/蛋白参与PCD或PCD的信号传导。这些物质包括酚类、胼胝质、活性氧中间产物(包括过氧化氢和自由氧基)、PR蛋白、植保素、水杨酸、茉莉酸、乙烯和一氧化氮等。有些物质发生在HR的下游,例如,HR可诱导水杨酸的积累,进而诱发植物的系统获得性抗性,相反,有些物质发生在HR的上游,例如活性氧中间产物可能直接诱导HR产生以及随后的防卫反应。有些分子,例如一氧化氮,具有多重功能,不仅与PCD有关,还参与植物的生长和发育。因此,除了发掘更多突变体和克隆分离相应的基因外,鉴定这些分子的靶标物质还有许多路要走,但这也是揭开植物病斑发生和PCD机理的关键。五、谷子类病斑突变体09-1115的发现及遗传分析从2005年开始构建谷子功能基因研究突变体库,通过多年积累,目前已经拥有15个稳定的形态学突变材料,其中包括类病斑突变体09-1115。对谷子类病斑突变体09—1115进行遗传分析,旨为实现突变基因的分子标记定位,以期为该基因的克隆及作用机理等方面的研究奠定基础。类病变的发生与植物细胞程序性死亡、抗病生理过程、光信号等相关因子转导途径以及活性氧与自由基的生理生化活动等紧密相关,是研究植物超敏反应激活机制的有利工具,对揭示植物抗病反应机理、了解植物细胞程序性死亡等具有十分重要的意义。上述斑点的共同特征是在无病原菌、无机械损伤、无农药残伤和无逆境的条件下产生的。有些斑点具有相对稳定的分布位置和大小,被称之为起始型(initiation)斑点。而另外一些斑点在形成后会很快扩散到叶片的其他部位,包括叶鞘和茎秆,故称之为扩散型(propagation)或反馈型(feedback斑点。之所以划分为起始型和扩散性两类,是因为认为植物中存在激发和抑制程序性细胞死亡2种途径。这种斑点叶突变体又被称为类病斑突变体(lesionmmiicmutant)因为他们共同的特征是斑点部位的细胞坏死,这种坏死斑叶与植物过敏性反应形成的病斑非常相似。根据突变性状受环境影响的敏感程度,类病变又可分为环境钝感型和环境敏感型，根据突变性状的发育进程还可分为全生育期型、营养阶段起始型和生殖生长阶段起始型。六、水稻类病变坏死突变体的形态观察及基因初步分析自70年代早期发现水稻第一个类病变坏死突变体sl（sekiguchilesion）以来，至今已发现了近百种类似的突变体。这些突变体虽然表现特征不尽相同，但类似的表型使人们推测它们之间有一些共同的机制，尤其是近年来发现类病变坏死突变体的表现与抗病和细胞程序化死亡有关，但植物死亡的机理仍不清楚。因此，发现新的细胞死亡突变体，定位和克隆与植物细胞死亡有关的基因是阐明植物细胞死亡机理的重要途径。遗传作图群体的构建在本研究中发现的水稻类病变坏死突变体lmm3，与以往在水稻中发现的sl、spl突变体的表型有很大差异。七、水稻类病变突变体lmm1的诱发与初步分析目前在水稻中也发现和诱发产生了该类突变体,包括自发形成和人工诱变的坏死(Sekiguchilethal,Sl)突变体、lmi突变体和lrd突变体等。利用不同浓度化学诱变剂EMS处理高抗稻瘟病水稻品种Katy干种子,获得一个水稻类病变坏死突变体lmm1,八、植物类病斑突变体的信号途径与抗病性研究进展类病斑一直作为一种抗性初始选择策略加以利用,这些发生机理的深入阐述,可望为定向选择出具有育种直接利用的抗病材料提供理论指导。植物为抵御病原菌的侵染,在进化过程中形成了一套复杂的防御机制,其中最为有效的是直接抗性反应即过敏反应(Hypersensitiveresponse,HR),当植物受到病原菌侵染时,被侵染的细胞以及周围的细胞快速凋亡,形成一定区域的坏死斑,从而抑制了病原菌的增长。目前,许多研究者在控制过敏性细胞凋亡的相关基因检测方面已开展了大量的工作,主要集中在不受控的细胞凋亡突变体上,这些突变常表现出自发性的细胞凋亡(Programmedcelldeath,PCD),因其表现型类似于病原菌诱导,故被称作类病斑突变(Lesionmimicmutation,LMM)。LMM最早在玉米中发现,随后相继报道于水稻、大麦和拟南芥。观察发现,这些LMM相关的表现型可能涉及到一些正常的病原菌感染激活的反应过程。研究这些LMM的特征及其控制基因,对了解植物细胞程序性死亡的整个信号传递途径和抗病机理具有重要意义,同时对选育相关抗病性状材料以及后续的改造也有积极的推动作用。本课题组通过诱变水稻品种9311获得了一系列LMM,在水稻中,类病斑突变体cdr(celldeathandresistance)表明蛋白磷酸化过程的改变导致了NADPH氧化酶活性的激活。事实上,许多植物LMM是在筛选与相关抗病性反应中获得的,对LMM多方面的研究有助于进一步了解细胞程序性死亡和防卫反应的途径。由于LMM与抗病性相关,它们还可作为一个直观的选择性标记辅助育种。国内包括浙江大学在内的研究机构也在这方面做了一些有益的尝试。随着这些发生机理不断被深入阐述,有望定向选择出具有育种直接利用的抗病材料。在筛选具有直接实用价值的抗病材料的研究中,我们注重新种质的系统抗性,即着眼于通过基因网络的有效调控,实现对不同类型的病害及不同生物生理小种均表现抗性,类病斑一直作为一种初始的选择策略加以利用。与此同时,为便于系统抗病性的快速育种利用,我们重点研究抗病性和优良农艺性状有机结合新材料的抗性机制。九、植物类病变突变体的诱发与突变机制植物类病变突变体(lesionmimicmutant,LMM)是在无明显逆境或病原物侵染时，植物自发地形成类似病斑的一类突变体。它涉及到细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)，往往能提高植物的抗病能力。因此，它对于揭示植物抗病反应机制，增加植物的广谱抗性具有重要意义植物和病原菌之间的作用机制一直是植物病理学研究的重点与热点课题之一。植物对病原物主要有以下两层防御体系：第一层是植物利用本身固有的基质或介质来抵制外界病原物的侵袭，而第二层防御体系是植物在受到病原物侵染后诱导产生的。人们又将该防卫体系分为局部和系统的抗病反应两种。前者主要是指过敏反应。为了探明植物过敏性反应的作用机制，学者们利用各种物理、化学和生物的方法诱发产生一系列细胞程序性死亡突变体。在这些突变体中，有一类表型像感病症状，但无病原菌孢子，人们称之为类病变突变体(lesionmimicmutant)。到目前为止，人们已在模式植物拟南芥和重要粮食作物玉米、大麦和水稻中获得许多此类突变体，并开展了一系列研究，包括类病变坏死表型的形成机制、突变基因的分子定位与克隆及其结构功能分析，并已取得显著进展。1植物类病变坏死突变体的诱发与表型特点除玉米与拟南芥外，目前在水稻中也发现和诱发产生了该类突变体，包括自发形成和人工诱变的坏死(sekiguchilethal,Sl)突变体、Cheng等和王建军等利用60Cog射线诱发产生的lmi突变体和lrd突变体等3类病变坏死表型的形成机制众所周知，任何生命现象或生理活动都不是由单单某一个因子决定的，植物类病变坏死突变表型的产生也不例外，它是由植物自身与外界环境中的众多因素所共同决定的。国内外许多学者对上述各种植物类病变坏死突变表型的产生机制进行了广泛而深入的研究，结果表明植物各种类病变坏死突变表型的起因存在以下几个方面：(1)植物类病变坏死的产生可能源自抗病基因的改变或过量表达从而不当地启动HR(包括早期步骤中的功能错误、信号受体和信号转导问题等)导致难以控制的细胞死亡。Hu等发现玉米抗锈病基因rp1发生突变可引发玉米叶片类病变坏死病斑的产生。Tang等发现番茄抗病基因Pto的过量表达可诱导类病变坏死表型的发生；(2)植物类病变坏死突变属于细胞程序性死亡的特殊类型，而后者在生物界非常普遍，它是生物自身发育与适应外界不良环境所具有的本能反应。因此任何干扰或影响正常PCD发生的因素都有可能引发植物类病变突变坏死表型的发生，即植物类病变坏死突变与植物PCD失控有关。限于篇幅，这里不展开论述；正常代谢途径发生紊乱也会引起植物的类病变坏死突变。Hu等对玉