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实验一：线虫RNA干扰的基因沉默一、实验目的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单而成为研究基因功能的有效手段。我们利用表达tag-214dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。二、实验背景RNAi是近年来以秀丽线虫的研究为基础而发展起来的一种基因knockdown技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。三、实验原理通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。当线虫以此大肠杆菌为食时，就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。本实验将利用表达tag-214dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。四、实验材料：1.秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）由于线虫的RNA的干扰操作简单快速，且重复性好，已成为鉴定基因功能以及基因间互相作用关系的有效材料。秀丽线虫属于线性动物门，线虫纲，小杆线虫目，广杆线虫属。秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。如上左图为秀丽线虫的模式图（上为雌雄同体，下为雄性个体），右图为秀丽线虫的生活史。线虫具有生活周期短，易培养和保存等优点，由于其身体透明，因此可以在显微镜下跟踪观察每个细胞的命运，是目前遗传学、发育学和细胞生物学研究的重要模式生物。2.大肠杆菌野生型菌株OP50菌株OP50是一种尿嘧啶缺陷型大肠杆菌，它涂布于NGM培养基上，由于该种大肠杆菌是尿嘧啶缺陷型，只能从NGM中获取尿嘧啶，无法自身合成。所以生长速度会比普通的大肠杆菌慢很多，这样既可以提供线虫食物，又不会过度生长。如果用普通的大肠杆菌，由于没有限制，会过度生长，而且湿度，氧气已经各种环境因素会制约线虫的生长。3.带有tag-214发夹结构质粒的HT115菌株将构建好的质粒转入大肠杆菌HT115，在IPTG诱导下成功获得目的基因对应的双链RNA。五、实验试剂：1.NGM普通固体培养基(1L配方)NaCl3.0g细菌蛋白胨16.0g蒸馏水1.0L琼脂16.0g1mol/LMgSO41.0ml1mol/LCaCl21.0ml高压灭菌后加入下列溶剂（每组分配以上溶液250ml）胆固醇250μL1mol/L磷酸钾缓冲液6.25ml配方(1L)KH2PO4129.25gK2HPO451.75g2.含有氨苄青霉素和IPTG的NGM固体基（用于RNAi）(1L配方)NaCl3.0g细菌蛋白胨2.5g蒸馏水974ml酵母提取物0.8g琼脂17.0g1mol/LMgSO441.0ml1mol/LCaCl221.0ml高压灭菌后加入下列溶剂（每组分配以上溶液250ml）胆固醇250μL1mol/L磷酸钾缓冲液6.25ml配方(1L)KH2PO4129.25gK2HPO451.75g1mol/L氨苄青霉素1.2mlIPTG的终浓度达到4mmol/L3.LB液体培养基(1L配方)NaCl1%牛肉膏蛋白胨1%酵母提取物0.5%加蒸馏水补足1L4.M9缓冲液(1L配方)Na2hpo45.8gKH2PO43.0gNacl1.0g蒸馏水1.0L5.氨苄青霉素和四环素抗生素氨苄青霉素(100mg/ml)四环素(100mg/ml)六、实验器材：天平实体显微镜酸度计水浴锅超净工作台灭菌锅恒温摇床恒温生化培养箱常温台式离心机七、实验步骤第一天i.配制实验试剂，并在超净工作台中配制NGM固体培养基和用于用于RNAi的NGM固体培养基.ii活化大肠杆菌OP50，挑取少量菌于3mlLB液体培养基内，37℃震荡培养20h左右.第二天i.铺菌，将200μL的OP50菌液接入到60nm的NGM平板中央，顺时针方向晃动平板使菌液尽量均匀分布在平板上，室温下放置干燥.ii.活化大肠杆菌HT115，方法同上，将control和带有tag-214基因的分别做好标记.第三天i.将10-20只rrf-3突变体的线虫接到铺有OP50的NGM平板上，在培养皿盖侧面标上线虫名称和日期，然后被放入到温箱中，20℃恒温培养.ii.再次活化HT115菌体，即从之前活化的菌液中control和tag-214的分别取30μL菌液加入到3mlLB液体培养基内，37℃震荡培养20h左右.第四天i.铺菌，分别将200μL的HT115的control和tag-214的菌液接入到60nm的NGM平板中央，顺时针方向晃动平板使菌液尽量均匀分布在平板上，室温下放置干燥第五天i.首先在实体镜下观察线虫的生长状况，当NGM平板上有较多的成虫时，可以进行以下操作：①取3ml的M9缓冲液加入到NGM平板上，反复轻轻地晃动平板，将平板上的线虫冲洗下来，然后将含有线虫的M9缓冲液转移到15ml的离心管中ii.向离心管中加入2ml的nacloro溶液和1ml的naoh溶液，之后马上盖紧盖子，剧烈晃动离心管。当发现溶液中的线虫身体呈现弯曲状，并且还没有出现絮状物时，加入M9缓冲液至11ml,以终止反应。iii.将离心管放入离心机中，3000r/min离心1min.iv.小心弃去上清液，加入M9缓冲液至11ml，再次离心3000r/min离心1min.v.再重复上一步。vi.将上清液弃去，留有底部沉淀和少量液体。沉淀中含有线虫的卵。小心吹打沉淀，并将沉淀滴入未铺菌的60nm的NGM培养皿的中央，并放入温箱中20℃恒温培养16-20h.第六天i.收获L1幼虫。培养16-20h后，NGM平板上的线虫发育成L1幼虫。取500uL的M9缓冲液冲洗平板中的线虫，并将冲洗下的L1幼虫放到1.5mL的离心管中。将L1幼虫平均分为两份，分别接到大肠杆菌HT115(对照组和实验组)的平板中。20℃培养。ii.Singleworm（挑单个虫）睫毛依次蘸取Naclo、70%乙醇、无菌水/M9缓冲液，在显微镜下分别挑取实验组和对照组的线虫，分别放在两个含有OP50的NGM固体培养板上，每个平板里放一定数目的线虫。iii.观察RNAi的表型和效率第二天在显微镜下观察实验组和对照组平板内的卵，并在其后的几天观察实验组和对照组平板内的卵是否能孵化成成虫。并对孵化出的成虫进行一个统计。八、实验结果我们小组观察实验组和对照组平板内的卵是否能孵化成成虫，并对孵化出的成虫进行一个统计。统计结果如下：实验组：卵数幼虫数孵化率161935056.54％298447448.17％34112.44％对照组：卵数幼虫数孵化率155754698.03％2232191.40％我们小组将对照组和实验组的虫卵数/接虫数取了平均值，并运用EXCEL做成了柱状图进行明显的比较。孵化率050100150对照组实验组孵化率%图1我们又对结果进行了方差分析，结果如下：我们小组又收集并分析了其他小组的数据和统计，同样也做了一个方差分析：0.00.20.40.60.81.0controlRNAi孵化率图2DependentVariable:孵化率SourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel5.603a15.603147.321.000Intercept9.25919.259243.460.000条件5.60315.603147.321.000Error1.52140.038Total16.38342CorrectedTotal7.12441a.RSquared=.786(AdjustedRSquared=.781)分析方差结果如图：从数据以及图标结果看来，对照组平均产卵比例远高于实验组的产卵比例，说明tag--214基因有控制线虫产卵的功能，当这种基因被沉默掉后，线虫的产卵率明显下降，另一方面也说明此次的RNA干扰实验做的比较成功，得到了与理论相一致的结果。但是在我们小组的实验过程中，我们也出现了一些问题，包括有平板的杂菌污染，还有就是有的平板挑出的线虫数目过多，所以长的卵特别多，所以对我们的查虫和计算产生了极大的干扰和困难。冲洗L1幼虫并分板培养的时候，尽量把幼虫的量平分，否则有的板长出来的虫多，有的少，而我们虫多的平板被污染了，所以后面RT-PCR的线虫是使用老师提供的线虫进行的实验。以后再进行此类实验，我们要吸取经验和教训，避免再犯类似的错误。