23动物的克隆

动物细胞全能性的特点？随着细胞分化程度的提高而全能性逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。离体的植物细胞和组织可以通过组织培养技术克隆成完整的植株，那么动物细胞和组织能否也进行同样的克隆？不能，动物细胞的全能性受到限制，到现在为止将离体的动物细胞直接克隆成个体还很困难，所以动物细胞和组织不能进行与植物一样的个体克隆。动物克隆的基础—动物的细胞和组织培养1、动物细胞培养（一）动物细胞、组织培养将动物体内的一部分组织取出分散成单个细胞放在适宜的培养基培养细胞得以生存并保持生命活动现象生长、分裂乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等机械消化或胰酶消化（1）定义离体动物细胞的生长特性：（1）贴壁生长：悬浮液中分散的细胞紧贴培养瓶内壁才能生长。（2）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂。（3）正常的生命活动：生长、分裂、有规律的衰老、死亡等现象，但不分化。细胞贴壁过程细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。接触抑制2、适宜的环境条件无菌、无毒环境：加抗生素，定期更换培养液适宜的温度和pH值：温度：36.5±0.5℃pH值：7.2-7.4适宜的气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）适宜的渗透压等培养条件成分：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和动物血清等1、含全部营养物质的培养液（2）动物细胞的培养过程从动物胚胎或幼龄动物组织切片中取小片样品转入特殊培养液原代培养分装到多个卡氏瓶中传代培养单个细胞悬浮液CO2培养箱中保温培养细胞系机械消化或胰酶消化（胰蛋白酶）培养过程动物组织细胞间隙中含有一定量的胶原纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。原代培养物选择或纯化选择或纯化细胞株细胞株二氧化碳培养箱通过在培养箱内模拟形成一个类似细胞或组织在生物体内的生长环境，如恒定的pH值（7.2-7.4）、稳定的温度（37°C）、较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平（5%），来对细胞或组织进行体外培养的一种装置。2、为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞思考1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养有关概念:将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增值。从机体取出后立即进行的细胞、组织培养，到培养的细胞形成生长晕并增大为止。原代培养：传代培养：严格说，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶为传代培养。为什么要传代培养？细胞悬浮液转入特殊培养液首次培养换瓶后培养原代培养传代培养为什么？到一定时期培养的细胞就会因为细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长原代培养传代培养…………原代培养物细胞系：可连续传代的细胞原代培养物在首次传代时就成为细胞系。能连续培养的连续细胞系不能连续培养的有限细胞系细胞系（二倍体细胞）（异倍体核型细胞）（1）恶性细胞系，异体致瘤性（2）保留接触抑制，不致癌（遗传物质改变，不死性）细胞株通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞系。如：单抗细胞株细胞株一般具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和生化特性等。遗传物质未改变。连续细胞株：可连续多次传代的细胞株。有限细胞株：传代次数有限的细胞株细胞系：泛指可传代的细胞。细胞株:具有特殊性质的细胞系。植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。2、动物组织培养3.动物组织培养与动物细胞培养的关系动物组织培养最终成了简单的细胞培养，两者在一定程度上可看作是同义词，统称为组织培养——代表各种生物体结构成分的体外培养。（二）动物组织培养技术的发展真正开始1885年鸡神经板在生理盐水中培养成活组织培养一词诞生1903年皮肤及白细胞培养与腹水和血清中，结果细胞的成活期达1个月，并且看到细胞分裂1907美国科学家将一部分蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，成功看到了神经纤维末端的阿米巴运动，解决了神经纤维起源问题，并创立了悬浮培养法萌芽1951通过对黑人妇女的宫颈癌组织的体外连续培养，获得肿瘤细胞系即不死细胞系-海拉细胞系1912年鸡胚细胞的培养1943科学家在致癌物20-甲基胆蒽的要倒下培养小鼠结缔组织，获得了能在小鼠体内生长肉瘤的L-细胞系组织培养工作进入了全新阶段（三）克隆培养法把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术1、定义：未经克隆的异质性细胞系纯系：克隆经克隆以后的细胞的后裔细胞群，来源于一个共同的祖细胞。2、产物:遗传性状均一、表现的性状相似3、细胞克隆的基本要求:必须保证所建成的克隆来源于单个细胞1.方法：诱导方式物理法：化学法：生物法：灭活仙台病毒聚乙二醇电刺激等4、克隆对象的选择依据：选择对培养环境具有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞。5、提高细胞克隆形成率的措施6、细胞克隆的用途从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系，方便科学研究如研究缺少某种特殊蛋白地的细胞，可以发现正常细胞中这种蛋白的功能。群体细胞单细胞无限细胞系、转化或肿瘤细胞原代细胞、有限细胞系•选择适宜的培养基•添加血清（胎牛血清）(能促进细胞的生长、增殖和贴附)•以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞）•激素刺激（胰岛素等）•使用CO2培养箱，调节PH2.过程：灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的仙台病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较1.其由何种细胞产生？2.主要分布在哪里？3.如何得到抗体？(三）单克隆抗体——动物细胞融合的重要应用抗体1、抗原动物体内刺激浆细胞抗原动物体内刺激浆细胞抗体抗原不纯抗体不纯筛选单一浆细胞不能增殖，产生大量抗体2、特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏设计方案：一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖单克隆抗体的优点：化学性质单一特异性灵敏度高杂种细胞单克隆抗体：单个杂交瘤细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体思考：（1）给小鼠抗原注射的目的是什么？诱导小鼠体内的特异性免疫应答，分化出浆细胞。（2）两次筛选的目的相同吗？不同，第一次筛选是为了筛选杂交瘤细胞，第二次筛选是做抗体检验，筛选产生特异性抗体的细胞。（3）最后培养有几种方案？两种，体内培养和体外培养。一、动物细胞全能性的表现程度桑椹胚八分裂球受精卵二分裂球四分裂球囊胚原肠胚幼体组织、器官1、动物的受精卵，卵裂球含有2-8个细胞时，每个细胞具有全能性。2、随着胚胎发育的继续，有的细胞只具有分化出多种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能干细胞。3、有的细胞只能分化为一种细胞，叫单能干细胞。受精卵胚胎干细胞多能干细胞单能干细胞体细胞2、低等动物细胞：全能性一般容易体现。1、高等动物细胞3、癌细胞：仍能逆转为正常细胞。无论分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性可以保留。一、动物细胞全能性的表现程度为什么动物细胞很难表现出全能性？水螅的消化细胞不经过细胞分裂即可转变为上皮、肌肉细胞。二、动物难以克隆的根本原因分化的细胞核中物种的基因组完整，具有全能性，但基因组中的基因不同时进行活动，有的基因甚至不表达任何基因产物。细胞分化使得细胞发生了基因的选择性表达，有的基因开放，有的基因关闭。体细胞基因组中的基因活动很不完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性。动物基因组一类基因：维持生存，各种细胞中都处于活动状态一类基因：随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。★如何实现动物的克隆？三、核移植和动物的克隆繁殖去核注核重组细胞1、核移植：利用一个细胞的细胞核（供体核）,来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞），使发育成一个新的个体。胚胎细胞克隆：使用的供体核来自胚胎体细胞克隆：使用的供体核来自体细胞1952年，罗伯特.布里格斯：豹蛙→囊胚细胞核+去核的卵母细胞→发育成个体1978年，童第周：黑斑蛙→成体红细胞核→去核的卵细胞中→发育成蝌蚪2、动物克隆繁殖：胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核移植。克隆羊培育过程黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲融合早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利体细胞核移植技术体细胞克隆羊的培育成功，证明了什么？高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。（核质互作）体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理：1、核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（调节牛血清浓度）和电脉冲细胞融合技术，有利于核的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。2、重组卵细胞最初分裂时虽然复制了DNA，但转录并未开始。3、供体核DNA丢失了来源于乳腺细胞的阻止核基因表达的调节蛋白。4、重组卵细胞开始第3次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因，进而调控在代孕母亲子宫中的进一步发育。体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术存在的问题：许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。动物克隆成功的条件：（1）具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞如：乳腺上皮细胞；（2）能有效调控细胞核发育的细胞质物质如：去核卵的细胞质；（3）完成胚胎发育的必要的环境条件如：诱导重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境动物克隆的意义：（1）有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育（2）对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义（3）丰富人们的物质生活，降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率动物细胞工程技术的基础是：（）A．动物细胞融合B．胚胎移植C．动物细胞培养D．核移植Ｃ