猪流感及生物学特性研究进展

中国农学通报2010,26(15):11-14ChineseAgriculturalScienceBulletin0引言猪流感病毒(SIV)属于单股负链RNA病毒，基因组大约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。8个基因片段中，片段1和片断2，最大为2341个核昔酸，分别编码不同长度的PB2和PB1。片断3-6分别编码队HA、NP和NA。片段7有3个读码框，编码基脂蛋白(M1、M2和M3)。逆转录出的MlmRNA和M2mRNA的5’端序列相同，并且共用翻译起始密码，故Ml和M2的前9个氨基酸是相同的。M3是一个连续的小mRNA，翻译能力有限，目前人们还没有分离到这一短肤。片断8最小，仅为890个核昔酸，有2个开放阅读框，分别编码NS1和NS2。猪流感以突发、咳嗽、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征。各种年龄、性别和品种猪均能感染，直接影响猪群健康状态和质量，对养猪业危害极大，由于其对呼吸道上皮细胞高度特异的亲嗜性而使呼吸道上皮管壁受到损伤，导致胸膜肺炎放线杆菌、嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪2型链球菌等细菌和猪呼吸繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪呼吸道冠状病毒(pRCV)等病毒的继发或混合感染[1]，死亡率增加。在猪群中广泛流行的主要有古典猪H1N1、类禽H1N1和类人H3N2毒株。古典型H1N1SIV主要以存在于欧美大陆，并于20世纪70年代传到亚洲并广泛流行。H3N2亚型SIV继1968年香港人流感流行过后，1969年在台湾的猪体基金项目：甘肃省自然科学基金“猪圆环病毒的环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立及应用”(0803RJZA050)。第一作者简介：丁耀忠，男，1976年出生，甘肃陇西人，硕士，主要从事病毒分子生物学研究。E-mail：[e-mail]。通讯作者：张杰，女，1971年出生，辽宁新民人，博士，主要从事疯牛病和口蹄疫分子生物学研究，SCI发表文章4篇。通信地址：730046兰州市徐家坪1号中国农业科学院兰州兽医研究所，Tel：[phone]，E-mail：[e-mail]。收稿日期：2010-03-12，修回日期：2010-03-24.猪流感及生物学特性研究进展丁耀忠，刘永生，陈豪泰，张杰(中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室，农业部兽医公共卫生重点开放实验室，兰州730046)摘要：猪流感(I)是由A型流感病毒引起的人畜共患病，被国际兽疫局和各国政府列为A类传染病，严重威胁到畜禽生产和人类自身生存安全，同时由于亚型多、抗原变异性强、宿主范围广等原因。其生态学和公共卫生学意义有极其重要的作用，就猪流感的生物学特性和其可能致病机理进行概述，从而阐述目前猪流感的研究现状。关键词：猪流感；生物学特性；A型流感病毒中图分类号：S855.9+9文献标志码：A论文编号：2010-0704SwineInfluenzaandAdvancesinBiologicalCharacteristicsofSwineInfluenzaDingYaozhong,LiuYongsheng,ChenHaotai,ZhangJie（LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,KeyLaboratoryofAnimalVirologyofMinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofVeterinaryPublicHealthofMinistryofAgriculture,Lanzhou730046）Abstract:SwineInfluenza(I)istheZoonosiswhichcauseedbytheInfluenzaAvirus,resently,haslistedoneofthemostimportantinfectiousdiseasebyOIEandEveryGovernment,andthreatofhumanbeing,ssafetyandproductionofanimals.Meanwhile,whichhasmanysubtype,strongantigenicvariationmicroorganismandwidehostrange.SIV'secologicalandpublichygienicssignificancealreadyacquiredmankind'shighlyconcern,ThePaperhassummarizedthebiologicalcharacteristicsandexploredpossiblepathogenesisofSIV.Keywords:swineInfluenza;biologicalcharacteristics;influenzaAvirus中国农学通报亚型，从发育进化看，香港分离株都来源于最早的人谱系，中国华南分离株则来自最早的人谱系和早期猪谱系，其进化率与H3N2人流感病毒相似，潜在危害十分严重。目前，SIV有三种血清型，即A型、B型和C型，在A型中已经发现的SIV亚型至少有7种，包括H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2。当前，公众和科研工作者对其的关注不仅仅在于兽医传染病学意义，更在于其潜在的公共卫生意义以及在流感病毒分子进化、分子流行病学及种间传播中不可替代的特殊地位和作用。流感病毒与其他病原体最大的区别是具有宿主泛嗜性，它可以感染几乎所有家禽、水禽、野禽、水生哺乳动物、猪、马、牛及人等[2]。研究认为，猪的种间屏障相对较低，是人流感病毒和禽流感病毒双重感染的“混合器”或活载体[3]。在2009年4月爆发的猪流感在短期内导致上百人死亡，而其也已迅雷不及掩耳之势威胁全球安全(为变异的H1N1,现命名甲流)。目前，对猪流感的控制于预防已经刻不容缓，就其诊断与病理学研究进行一些说明，为其进一步的研究提供一些依据。1猪流感的诊断概述目前国内外猪流感的诊断方法，大致可分为五种：一是病毒分离，包括鸡胚和细胞接种，病毒分离被视作实验室诊断的标准，但缺点是所耗时间较长，而且只能在专门的实验室进行，往往不能及时防制措施提供依据；二是检测病毒核酸，最常用的是反转录PCR，若利用多对特异性引物进行多种PCR还可以同时检测不同亚型的；三是检测病毒蛋白，如荧光抗体方法和免疫组化方法，这类方法的敏感性虽不及PCR，但可满足快速诊断的需要；四是利用免疫学方法检测血清中的特异性抗体，这是目前最广泛的实验室诊断方法，常用的是血凝抑制试验(HⅠ)，酶联免疫吸附试验(ELISA)；五是生物传感器和基因芯片技术，检测时间更短，敏感性更高，特异性更强[4-5]。2猪流感病毒蛋白蛋白质是SIV病毒粒子的主要成分，具有重要的功能，其主要有以下多种蛋白质成分组成。2.1血凝素(HA)HA是病毒主要的表面糖蛋白，属于典型的I型糖蛋白，分子量为75ku，大约由562~566个氨基酸组成。HA由信号肤、胞浆域、跨膜域和胞外域含4个结构域构成。HA由HA1和HA2组成，HA1由328个氨基酸组成，具有与宿主细胞受体结合的特性；HA2由221个氨基酸组成，是参与和细胞融合的重要亚单位。HA以三聚体的形式镶嵌在双层类脂膜上，每个HA单体可分成两部分，HA1构成的球形头部，含有受体位点和抗原决定簇；另一部分为柄，由HA1一部分和整个HA2组成，插入囊膜。SIV的受体是位于细胞膜上的唾液酸糖脂和唾液酸糖蛋白，HA头部最外面是半乳糖，能和细胞膜上的受体相结合，从而使SIV感染细胞。SIV的HA受体结合部位呈口袋状，其位点相当的保守，如98位上的Tye，153位的Trp，183位的His，190位的Glu，194位的Leu。如果受体位点上的某个氨基酸发生变异，不仅能引起抗原性变异，还能改变受体和病毒的结合能力。另一方面在病毒粒子脱壳时，形成酸化环境，激活HA的融合功能[6]。2.2神经氨酸酶(NA)Hirstl首次发现流感病毒表面具有活性，NA主要构成病毒囊膜纤突，属于Ⅱ类糖蛋白。NA包括4个结构域：6个氨基酸的氨基端胞尾、29个氨基酸的非极性跨膜区、28个氨基酸的茎部以及390个氨基酸的头部序列。NA的氨基酸端胞浆尾都是N-Met-AsP-Pro-AsP-Gly-Lys-C，NA只有一个疏水区。非极性跨膜区靠近N末端，其功能是将NA固定在双层类脂膜上。NA各亚型的茎部氨基酸的长度和序列都有一定的差别。SIV的头部相对的保守，所有的病毒中Lys所在的位点一样。NA头部的11个保守氨基酸在三维结构中构成了NA的酶活性中心，NA能水解红细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酞神经氨基酸，使凝集到红细胞的病毒解脱下来，或从感染的细胞中释放来。另外，NA可以阻止病毒粒子的吸附，NA吸附的牢固程度，关系到病毒是否以最佳的方式进行复制[7]。2.3核蛋白(NP)NP由病毒片段5编码，大约为500个氨基酸。NP是病毒核蛋白，具有型特异性，主要决定宿主范围。NP是螺旋形核衣壳的主轴，与RNA片段及各种聚合酶相连，在感染的细胞或病毒体中以磷酸化形式在。NP至少有3个互相重叠的抗原区，其中一个区在各型流感病毒间均存在。针对这一区的单克隆抗体可抑制病毒KNA的转录，说明NP在mRNA到RNA转录过程中起着开关作用，NP的核苷酸相对的保守[8]。2.4基脂蛋白(M)M为疏水性蛋白，富含精氨酸，其编码基因为片段7，具有3个读码框，由250个氨基酸组成，能诱导子代病毒的组装，具有型特异性抗原活性。M1感染细胞··12丁耀忠等：猪流感及生物学特性研究进展的阶段不同，其作为结构蛋白所表现出的功能也有所差异。在成熟病毒中，病毒脱壳时，释放核糖核蛋白。在感染细胞中，Ml则与核糖核蛋白结合，使其自细胞内转移到核外。M2由97个氨基酸组成，其核苷酸最保守。M2为非糖基的跨膜蛋白，以四聚体形式组成寡聚体，大量存在感染细胞的表面，但在成熟病毒粒子内和囊膜表面含量很少。M2在感染细胞内作为质子通道，一方面控制高尔基体的pH值，保证HA经过时的完整性；另一方面在病毒粒子脱壳时，形成酸化环境，激活HA的融合功能。M3由14个氨基酸组成，对其功能，目前还不清楚[9]。2.5聚合酶蛋白(pA、PB1和PB2)PA、PB1和PB2由病毒片段l、2和3编码，分别由720、760和760个氨基酸组成。3个聚合酶蛋白与核蛋白和病毒相连接，构成病毒特异性的聚合酶复合体，具有转录和核酸内切酶的活性。其中PB2识别并裂解宿主细胞mRNA端帽子结构，以此作为病毒转录的引物;PB2具有使模板mRNA和病毒mRNA不断延长的作用；PA的功能未明，可能是一解链蛋白，或具有蛋白激酶活性。通过对不同毒株间的P蛋白核昔酸和氨基酸序列分析，发现大多数PA蛋白的氨基酸均高度保守[8,10]。2.6非结构蛋白(NS1和NS2)NS有两个阅读框，分别编码NS1和NS2，NS1是线性mRNA编码产物，大约202以上个氨基酸。NS2由剪接的mRNA转录而来，有121个氨基酸。序列表明，NS1和NS2有70个氨基酸重叠。NS1蛋白含有2个核定位信号区，其中34-38氨基酸高度保守，为Asp-Leu-Arg-Arg，第2个信号区在203~207位氨基酸处。NS1主要存在于感染细胞的核内，而NS2存在于感染细胞内。NS1分子的氨基酸残基和磷酸基团共价连接，磷酸化的NS1蛋白可调节病毒复制过程。NS2和M1蛋白结合共存在于病毒体内，其具体的作用还不明确[11]。3SIV的生物学特性3.1血凝特性血凝特性是SIV的一个重要的生物活性，其血凝谱相当的广泛。在一定的条件下，SIV能凝集鸡、豚鼠、大鼠、小鼠、兔、牛、人等红细胞。在实际的