293细胞的大规模培养

293细胞的大规模培养293细胞是腺病毒载体的包装细胞。腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门载体。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞293中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此完善293细胞的大规模培养技术具有越来越重要的市场意义。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞特性293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾细胞。它是加拿大McMasterUniversity的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型成上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293细胞为人亚三倍体细胞系。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。转瓶培养转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。与传统静止单层培养相比，转瓶具有三大优点：为细胞提供较大的生长表面；轻微的转动可以防止培养液中形成的某些成分对细胞生长可能产生的影响；细胞大部分时间仅覆盖一薄层培养液，有利于气体交换。我们已成功实现293细胞的转瓶培养。由于293细胞对生长环境的改变较为敏感，细胞容易成团，因此维持稳定的温度、酸碱度和转动速度对细胞正常均匀生长至关重要。现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两部分。293细胞接种后，维持适当的转速培养。不同的细胞转速略有不同。细胞的均匀分散贴壁情况与培养液温度、瓶子的转动速度和细胞特性有关。在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍。反应器贴壁培养此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。CelliGen、CelliGenPlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞的贴壁培养时可使用篮式搅拌系统和圆盘状载体。此载体是直径6毫米的无纺聚酯纤维圆片，具有很高的表面积与体积比（1200cm2/g），有利于获得高细胞密度。篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多的方式，除用于293细胞的培养外，还用于杂交瘤细胞培养、Hela细胞培养、CHO细胞培养及其它细胞培养。此种方式培养293细胞，细胞接种后贴壁快，接种1小时后细胞贴壁率可达98%以上，采用灌流培养。整个培养周期约7-10天，细胞增殖25-50倍。微载体培养微载体是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。常用商品化微载体有三种：Cytodex?，Cytopore和Cytoline。使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGenPlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。微载体培养293细胞，首先要选择合适的微载体类型和搅拌速度。接种细胞可用1Lspinner微载体培养系统或是其它贴壁培养方式准备，采用灌流培养，培养周期10-15天，能达到的细胞密度为5-10×106/ml。无血清悬浮培养无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。要实现293细胞无血清悬浮培养必须先将贴壁培养293改造为悬浮培养293S细胞并寻找适合高密度无血清培养的培养液配方。悬浮培养时，由于缺少血清和蛋白的保护作用，293S对剪切力的敏感度增加，难以达到高密度培养，导致293S产生病毒的数量比贴壁培养低5-10倍左右。细胞接种后，灌流培养7天，达到细胞密度5×106/ml，增殖5-10倍。结论不管是哪种培养方式，首要的一点是必须操作规范、防止污染；其次根据需要选择合适的293细胞培养方式，对细胞生长状况实行有效的监控，以便获得稳定的蛋白或病毒产物。人胚肾细胞株293细胞(由中科院上海生化研究所许德华教授惠赠)在含10%胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的DMEM培养液(GIBCO/BRL公司产品)，37℃,5%CO2的环境中生长。第四节细胞培养与细胞杂交一、细胞培养高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（invivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（invitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cellculture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。（一）、动物细胞培养细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养（massculture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；另一种是克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中；各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。目前实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞人BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫HenriettaLacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。1．原代培养（primaryculture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群，。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。2．细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。3．细胞系（cellline）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖4．克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。图2-24群体培养（左）和克隆培养（右）二、细胞融合真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交（cellhybridization）。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用，正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。图2-25单克隆抗体技术第五章细胞培养和细胞工程细胞培养是细胞生物学研究必不可少的实验手段，近年来细胞培养又成为生物技术领域中常用的生产手段。细胞培养和其他技术方法，如：细胞的显微操作（在显微镜下移去或移入细胞核等），细胞融合，染色体操作等结合在一起，组成了细胞水平的生物技术操作群，是生物技术领域的研究和开发应用中必不可少的部分。把细胞水平生物技术用于生产称为细胞工程。细胞培养实验的基本条件是：细胞来源，培养基（各种营养成份，小牛/胎牛血清），培养器械（培养瓶或罐，恒温箱／室等）。细胞来源：直接从活体组织中分离出细胞，在培养条件下传１至１０代，称为原代培养。原代培养一般不能传代太多，否则培养细胞会走向衰老死亡。经过一定处理，细胞适应在体外条件下连续传代培养，称为传代培养。一般可传４０至５０代的细胞，称细胞株。有的细胞株转化后可传５０代以上，甚至一直传下去，称为细胞系。细胞培养技术：除了常规的细胞培养技术外，还发展了多种特殊培养技术，以适应研究和生产的特殊需要。无血清培养----通常哺乳动物细胞的培养，除了需有各种必要的营养成份外，还需加入10%小牛／胎牛血清。血清提供多种蛋白质生长因子。在初步弄清血清中生长因子成份后，发展出多种无血清培养技术，即培养基中不加血清，而代之以各种生长因子，以适应特殊研究的需要。同步培养----一般来说，在培养的细胞群体内，各个细胞处于生长周期的不同阶段。运用特殊的技术方法，可使各个细胞处于生长周期中相同位置，同步向前发展。一些特殊的研究课题需要同步培养。悬浮培养----通常培养的细胞会贴着培养瓶的底部内壁生长，长到把底面积覆盖满就停止生长。这是正常细胞生长中的一种特性，即接触抑制。在生产中，常常需要培养液中细胞密度增加，则需要采用悬浮培养的方法。单克隆抗体技术：若要大批量生产蛋白质抗体供医学上诊断和治疗，会遇到两个方面的困难：1.大量免疫动物，再从免疫过的动物抽取血清，是一个很费时的操作。2.从动物血清得到的抗体中，除了希望得到的抗某种抗原的抗体外，往往杂有其他抗体。把需要的抗体纯化出来，也是一个费时的过程。针对上述两个方面的问题，采用单克隆抗体技术从细胞培养中获取特异的单克隆抗体，使抗体的大规模实际应用成为可能。单抗技术的要点是从经某种抗原（如：甲抗原）免疫过的小鼠脾脏分离得到脾细胞（大部份为B-淋巴细胞），用以和小鼠骨髓瘤细胞融合杂交。所产生的杂交瘤细胞再经单细胞培养挑选，即可获得能产生专门针对甲抗原，甚至仅仅针对甲抗原大分子中某个抗原决定簇的单克隆抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体技术的关键是：利用免疫过的小鼠脾脏中B-细胞的产生抗体的能力，以及骨髓瘤细胞的无限繁殖的能力，两者杂交以后产生的杂交瘤细胞兼有产生特异抗体和无限繁殖两种特