搜索
一般毒理学研究国家上海新药安全评价研究中心马璟2007-9一、一般毒理学的概念毒性作用类型-按毒作用发生时间分类：急性毒作用（acutetoxicaction)慢性毒作用（chronictoxicaction)迟发性毒作用（delayedtoxicaction)远期毒作用（remotetoxicaction)-按毒作用部位分类：局部毒作用（localtoxicaction)全身毒作用（systemictoxicaction)-按毒作用损伤的恢复情况分类：可逆性毒作用（reversibletoxicaction)不可逆性毒作用（irreversibletoxicaction)一般毒理学的概念按毒性性质分类：特殊毒作用：过敏反应（allergicreaction)特异体质反应（idiosyneraticreaction)致癌作用（carcinogenesis)致畸作用（teratogenesis)致突变作用（mutagenesis)一般毒作用：指化学物质在一定的剂量范围内经一定的接触时间，按一定的接触方式产生的毒作用。一般毒理学的概念一般毒理学（基础毒性）：研究化学物质在一定的剂量范围内经不同染毒期限时间产生的毒效应。包括系统毒性和局部毒性的研究。意义：是化学品安全性评价和危险性评价的重要组成部分；可发现毒性作用的靶器官。一般毒理学的概念一般毒理学分类：急性毒性研究亚急性毒性研究（亚慢性毒性研究）长期毒性研究蓄积毒性研究局部毒性研究1.急性毒性研究概念：是指动物一次或24小时内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应。1927年由Trevan引入LD50的概念，现国内、外均有法规。目的：确定或估算LD50，进行毒性分级提示化学物可能的靶器官及特殊毒作用，为机理研究提供线索为长期毒性研究提供方案设计依据急毒上限参数：以死亡为检测终点绝对致死剂量（LD100)半数致死剂量（Medianlethaldose,LD50）：在一定试验条件下引起50%动物死亡的剂量。最小致死剂量（Minimallethaldose,MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量最大耐受剂量（Maximaltolerancedose,MTD）：不引起受试对象死亡的最高剂量。急毒上限参数：以非致死性急性毒作用为终点最小毒性反应剂量（LOAEL）：观察到有害作用的最低剂量最大无反应剂量（NOAEL）：未观察到有害作用的剂量急性毒性研究发展：由OECD（OrganizationofEconomicCorporationandDevelopment）于1987提出的动物急性毒性试验称为经典的急性毒性试验（大鼠，3组），为新药的开发作出了重要贡献。美国、欧盟、日本为了国际注册要求的统一协调，于1991年召开了第一次人用药品注册技术要求国际协调会（ICH1），建议采用两种啮齿类动物或一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物的严格设计的、单次给药的、逐渐增加剂量的耐受性研究，取代啮齿类动物或非啮齿类动物半数致死量（LD50）测定的要求。在1997年进行的第二次ICH会议中，又对支持单次给药临床试验的动物急性毒性试验进行了讨论。急性毒性研究我国在1993年和2001年分别发布了两版有关急性毒性试验的指导原则，在我国的新药研发中发挥了重要作用。目前，在我国原指导原则的基础上，结合我国科研实践的经验和具体情况，参考ICH框架下三方各国的指导原则，正在制定既符合我国国情又符合国际注册要求的动物急性毒性研究技术指导原则。急性毒性研究基本原则A.具体问题具体分析的原则急性毒性研究的试验设计应该在对于受试物的认知的基础上，根据化合物的结构特点和理化性质，遵循“具体问题具体分析”的原则进行。B.随机、对照、重复的原则急性毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复的原则。急性毒性研究试验条件必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。受试物与临床试验受试物和上市药品符合同一质量标准。受试物应标明名称、批号、来源、理化性质、纯度、稳定性、保存条件和配制方法，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。如果受试物为复方制剂，建议进行各成分单独给药的试验和按复方制剂比例联合给药的试验，以提示有无增毒作用，或是否出现新的毒性。如果受试物在贮存条件下易发生降解，建议以含降解产物量最高的受试物进行急性毒性试验，并与临床样品的急性毒性试验结果比较。急性毒性研究动物1、种属：急性毒性试验应采用至少两种哺乳动物，根据药物的特点，可选用一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物进行试验。2、性别：通常采用两种性别的动物进行试验。3、年龄：通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童，建议考虑采用幼年动物进行相应的毒理试验。4、动物数：对于所用的动物数，应根据动物的种属和试验目的来确定，通常小动物的每组数目相对多于大动物的数目。动物数选择的一般原则是在获得尽量多信息的前提下，使用尽量少的动物数。动物数应符合结果分析评价的要求。5、体重：动物初始体重不应超过或低于平均体重的20%。应符合国家有关规定的等级要求，并具有实验动物质量合格证。急性毒性研究给药途径给药途径不同，受试物的吸收率、吸收速度和暴露量会有所不同，因此需要采用多种给药途径进行急性毒性试验。另外，通过不同途径给药所得结果的比较，可以获得一些初步的生物利用度信息。通常，给药途径应至少包括临床拟用途径和一种能使原型药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。急性毒性研究给药剂量急性毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应，应以近似致死剂量下观察出现的毒性和剂量间的量效关系为主。可选择适当的方法进行急性毒性评价，对于非啮齿类动物给予出现明显毒性的剂量即可，给药剂量没有必要达到致死水平。对于毒性较大的或需要参考LD50值来估计临床初始剂量的药物，研究者根据药物的具体情况设计给药剂量水平，可采用适当的方法求算LD50值。总体上，给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性(危及生命的)剂量，同时设阴性对照组（溶剂对照组）。急性毒性研究观察时间及指标给药后，连续观察至少14天。观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间、是否可逆等。对于所有的试验动物均应进行大体解剖，包括实验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活而处死的动物。任何器官出现体积、颜色、纹理改变时，均应记录并进行组织病理学检查。急性毒性研究急性毒性研究数据分析及评价1、根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的量效关系及随时间的变化。2、判断出现的各种反应可能涉及的器官、组织或系统等。3、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。4、根据不同剂量组各种反应的发生率、动物死亡情况等，确定动物对受试物的最大无反应剂量、最小毒性反应剂量、最大耐受剂量、最小致死剂量等，初步判断药物的安全范围。5、对于需要测定LD50值的药物，采用合理的统计学方法求算LD50值。6、说明所使用的计算方法和统计学方法，提供所选用方法合理性的依据急性毒性试验常用试验方法1.最大耐受量法一般使用10-20只动物，连续观察14天。2.最大给药量法对于某些低毒的受试物可采取该方法。在合理的给药浓度及合理的给药容量的条件下，以允许的最大剂量单次给药或24小时内数次给药(一般不超过5g/kg体重)，观察动物出现的反应。一般使用10-20只动物，连续观察14天。急性毒性研究3、半数致死量法4、固定剂量法（Fixed-doseprocedure）该方法最初于1984年由英国毒理学会提出，不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量进行实验，特殊情况下可增加5000mg/kg剂量。实验动物首选大鼠，采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。正式试验每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验。。急性毒性研究急性毒性研究5、上下法（阶梯法，序贯法，UpandDownMethod）该方法由Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce进行了改进，目前是OECD和EPA推荐的方法之一。其最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。该方法分为限度实验和主实验。限度试验主要用于有资料提示受试物可能没有毒性的情况，最多用5只动物进行的一个序列试验。试验剂量为2000mg/kg，特殊情况下也可使用5000mg/kg。急性毒性研究6、近似致死剂量法(ApproximateLethalDose–ALD)该方法主要用于非啮齿类的动物试验。一般用6只健康的Beagle犬或猴。根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。急性毒性研究7、累积剂量设计法（金字塔法，Pyramidingdosagedesign）在非啮齿类动物进行急性毒性实验可采用此方法。经典的实验设计需要8只动物，分对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。剂量的设计可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时止。亚慢性和慢性毒性研究概念：亚慢性毒性（subehronictoxicity)：动物连续（1-3个月）重复染毒所引起的毒性效应慢性毒性（chronictoxicity):实验动物长期染毒引起的毒性效应目的：①发现受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效和时效关系、可逆性等；②判断受试物反复给药的毒性靶器官或靶组织；③推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全范围；④提示临床试验中需重点监测的安全性指标；⑤对毒性作用强、毒性症状发生迅速、安全范围小的化合物，长期毒性研究还可以为临床试验中的解毒或解救措施提供参考。亚慢性和慢性毒性研究基本原则整体性原则新药的开发是一个连续的、渐进的系统工程，长期毒性研究是新药开发的一个有机组成部分。长期毒性研究不能与药理学、药代动力学和其它毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其它药理毒理研究的试验设计和研究结果。长期毒性研究的结果应该力求与其它药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。具体问题具体分析长期毒性研究的试验设计应该在对受试物的认知基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则进行。试验设计应根据化合物的结构特点和理化性质、同类化合物在国内或国外的临床使用情况、临床适应症和用药人群、临床用药方案、相关的药理学、药代动力学和毒理学研究信息等综合考虑。随机、对照、重复长期毒性研究的试验设计应遵循“随机、对照、重复”的原则。亚慢性和慢性毒性研究试验动物1、试验动物种属或品系的选择长期毒性研究一般采用两种试验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类。①对受试物的生物转化与人体相近；②对受试物敏感