王镜岩生物化学课件PPT-第14、15章 核酸的物理化学性质

Chapter13核酸的物理化学性质NNNHNNH2Chapter14核酸的研究方法Chapter13核酸的物理化学性质一、核酸的水解（一）核酸的酸水解或碱水解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′或3′磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。DNA一般对碱稳定，RNA对碱不稳定。（二）核酸的酶水解一、核酸的水解生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′端或5′端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。Chapter13核酸的物理化学性质Chapter13核酸的物理化学性质一、核酸的水解（二）核酸的酶水解脱氧核糖核酸酶类1、牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)：从5′磷酸末端切下寡聚核苷酸。2、牛脾脱氧核糖核酸酶(DNaseII)：从5′磷酸末端切下寡聚核苷酸。3、限制性内切酶：存在于细菌体内，用于专一性地降解外源的DNA，限制性内切酶已成为基因工程最重要的工具酶。如EcoRI（请看教材503—504页）二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸碱性质Chapter13核酸的物理化学性质1、分子量在数百至数百万之间；微溶于水，不溶于有机溶剂；变性时粘度降低；2、核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离。在一定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等电点。Chapter13核酸的物理化学性质三、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰波长（λmax）在260nm处，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。Chapter13核酸的物理化学性质三、核酸的紫外吸收摩尔磷消光系数508页增色效应：核酸发生变性时，摩尔磷消光系数增加的现象。减色效应：复性后，摩尔磷消光系数又降低的效应。Chapter13核酸的物理化学性质四、核酸的变性、复性及分子杂交(一)核酸的变性(denaturation)核酸的变性:维系核酸三维结构的碱基堆积力和氢键如果受到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的变性。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变。Chapter13核酸的物理化学性质四、核酸的变性、复性及分子杂交核酸的变性的特征DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将引起DNA变性的温度称为融点，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44影响DNATm大小的因素：DNA的均一性；G—C的含量；介质中的离子强度。Chapter13核酸的物理化学性质四、核酸的变性、复性及分子杂交当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260nm)值升高,粘度降低等。Chapter13核酸的物理化学性质四、核酸的变性、复性及分子杂交(二)核酸的复性(renaturation)核酸的复性:变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。(二)核酸的复性(renaturation)Chapter13核酸的物理化学性质四、核酸的变性、复性及分子杂交(三)核酸的杂交(hybridization)热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southernblotting（Southern印迹法）：DNA-DNA杂交Northernblotting（Northern印迹法）：DNA-RNA杂交Westernblotting（Western印迹法）：抗原-抗体结合510页(三)核酸的杂交五、核酸的沉降特性Chapter13核酸的物理化学性质超速离心法纯化核酸。分离DNA常用氯化铯密度梯度；分离RNA常用蔗糖密度梯度；应用啡啶嗅红-氯化铯密度梯度平衡超离心可将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开，是实验室最常用的纯化质粒DNA的方法请看515页Chapter13核酸的物理化学性质六、核酸的凝胶电泳1、琼脂糖凝胶电泳：分析分子量大于1000bp的DNA片段请看516页2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：分析分子量小于1000bp的DNA片段七、DNA的固相合成520页八、DNA的限制酶图谱限制性内切酶来源于细菌，高度专一地识别外源DNA上的特定位点，并将其切断，形成形成粘性末端或平齐末端。不降解自身细胞的DNA。因为在自身相应位点上经甲基化修饰而受到保护。DNA的限制性内切酶图谱何叫回文结构？A—T—C—G—A—T—C—G—A—T—C—G—A—TT—A—G—C—T—A—G—C—T—A—G—C—T—A即对某DNA上所有的限制性酶切位点的确定。本节完