环境中微生物的检测-WWWSOPPTCN

第六章环境中微生物的检测第一节水体中的微生物一、水体是微生物的天然生境无论是海水还是淡水水体中，都有着微生物生长所必需的营养，有着土壤所具备的条件。二、水体中微生物的数量和分布1.污染淡水处于城镇等人口聚集地区的湖泊、河流等淡水。108~109个/mL水主要是一些能分解各种有机物的腐生菌，如芽孢杆菌、生孢梭菌、变形杆菌、大肠杆菌、粪链球菌等。有的甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱、肝炎等人类病原菌。2.清洁淡水（1）溪流及贫营养湖10~100个/mL水以自养型种类为主。常见细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝细菌、柄细菌、赭色纤发菌、球衣菌和萤光假单胞菌等。此外，还有许多藻类（如绿藻、硅藻等）、原生动物（如钟虫及其他固着型纤毛虫、变形虫、鞭毛虫等）和后生动物（如枝角类、桡足类等）。（2）地下水、自流井、山泉及温泉有机物和微生物都很少石油岩石地下水含分解烃的细菌，含铁泉水有铁细菌，含硫温泉有硫磺细菌。3.影响微生物在淡水水体中分布的因素水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、pH及水深等。4.海水除了一些从河水、雨水及污水等带来的临时种类外，绝大多数是耐盐、嗜冷、耐高渗透压和耐高静水压力的种类。海水中常见的微生物有假单胞菌属、弧菌属、黄色杆菌属、无色杆菌属及芽孢杆菌属等。一般在港口，每毫升海水含菌量为1×105个，在外海每毫升含菌为10~250个。各种用途的水质标准标准名称及标准编号项目标准值生活饮用水卫生标准GB5749-85细菌总数(个/mL)≤100总大肠菌群(个/L)≤3生活饮用水源水质标准CJ3020-93总大肠菌群(个/L)一级≤1000二级≤10000地表水环境质量标准GB3838-2002粪大肠菌群(个/L)Ⅰ≤200Ⅱ≤2000Ⅲ≤10000Ⅳ≤20000Ⅴ≤40000地下水质量标准GB/T14848-93细菌总数(个/mL)Ⅰ～Ⅲ≤100Ⅳ≤1000Ⅴ﹥1000总大肠菌群(个/L)Ⅰ～Ⅲ≤3Ⅳ≤100Ⅴ﹥100景观娱乐用水水质标准GB12941-91总大肠菌群(个/L)粪大肠菌群(个/L)A类≤10000A类≤2000农业灌溉水质标准GB5084-92粪大肠菌群(个/L)≤10000渔业水质标准GB11607-89总大肠菌群(个/L)≤5000≤500（贝类养殖水质）海水水质标准GB3097-1997总大肠菌群(个/L)≤10000≤700（贝类养殖水质）（一）细菌总数测定菌落总数——需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数.作用：判定水体被细菌污染的程度基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。三、水的细菌学检测1、样品的处理和稀释操作要求：“无菌操作”贯彻始终。充分振摇或研磨25g或25ml检样225mL稀释液含有玻璃珠的灭菌玻璃瓶或乳钵1：10稀释液。1ml1ml1ml9ml稀释液1：1009ml稀释液1：10009ml稀释液1：10000减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。2、稀释样品的取样和倾注平皿每个稀释度做两个平皿将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。1.取样倾注平皿1：10稀释液225mL无菌水1mL1mL9mL稀释液1：1009mL稀释液1：10001mL1mL1mL1mL1mL1mL1ml无菌水25g或25ml检样3、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。菌落总数报告方式计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀释度的各平板平均菌落数。规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。报告原则菌落总数报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落数(个/mL)报告方式(个/mL)10-110-210-31136516420—22760295461.632890271602.24无法计数4650513—527115—6无法计数30512—7无法计数无法计数无法计数164001.6×104377503.8×104271002.7×1045130005.1×1052702.7×102305003.1×10410-3无法计数菌落总数报告方式计数原则：选平均菌落数在30~300之间者进行计算2.若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之。4、菌落总数报告方式菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。(二)大肠菌群测定——国家标准采用三步法1、检验查表方法大肠菌群——需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。乳糖发酵试验分离培养证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。较清洁样品的三步法图示100mL50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水样10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL三步法图示取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰平板上进行划线取有核心和带金属光泽的深紫色菌落进行革兰氏染色乳糖蛋白胨培养液镜检（革兰氏阴性菌）37℃培养48h证实产气（阳性）结果与否37℃培养24h37℃培养24h大肠菌群测定2、计算方法挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。为阴性结果的水样体积（mL）×全部水样体积（mL）MPN＝1000×为阳性结果的发酵管（瓶）的数目产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。练习：如对一自来水厂出水进行检验，初发酵一般在10支小发酵管和两支大发酵瓶内进行，复发酵在5支小发酵管内进行。以300mL进行初发酵实验，其中100mL的水样2份（分状于2个大发酵瓶中），10mL水样10份，（分状于10支个小发酵管中）。实验结果：100mL的2份水样为阴性结果，无大肠杆菌存在；10mL的水样中有5份为阳性结果，存在大肠杆菌。则：为阴性结果的水样体积（mL）×全部水样体积（mL）1000×为阳性结果的发酵管（瓶）的数目MPN＝=MPN＝1000×5250（mL）×300（mL）第二节空气中的微生物空气的生态条件——不适合微生物生长繁殖。（营养不足、紫外线照射、水分少）。一、空气微生物的来源空气中的微生物主要来自土壤飞起来的灰尘、水面吹起的水滴、生物体体表脱落的物质、人和动物的排泄物等。二、空气中微生物的数量和分布空气中的微生物大部分是腐生的种类，但是不同的空气环境中微生物的种类不同。有些种类是普遍存在的，如某些霉菌、酵母菌、真菌孢子。细菌主要是来自于土壤的腐生性种类，常见的为各种球菌、芽孢杆菌、产色素细菌等。空气中微生物的分布随环境条件及微生物的抵抗力不同而呈现不同的分布规律。空气中微生物的数目决定于尘埃的总量。空气中尘埃含量越高，微生物的种类数量越多。表4-2不同条件下1m3空气的含菌量条件数量畜舍1~2×106宿舍20000城市街道5000市区公园200海洋上空1~2北极（北纬80o）0三、空气微生物的卫生标准室内空气污染的指标：＞500～1000个/m3。清洁程度细菌总数（个/m3）清洁程度细菌总数（个/m3）最清洁空气1～2临界环境～150清洁空气30轻度污染300普通空气31～125严重污染301四、空气中微生物的检测方法•常用的检验方法是沉降平板法，即测定在一定时间内从空气中降落到单位面积地面上的微生物个数。操作过程如下：•将融化的营养琼脂培养基倒入d90mm无菌培养皿中制成平板。均匀布设在待测处地板上（一般最少设5个待测点），打开皿盖5～10min，让空气中的微生物降落在平板表面，盖好皿盖，然后倒置放入培养箱中，在37℃条件下培养48h后计菌落数。•式中：C——空气细菌数；（个/m3）N——菌落数（个）；A——平皿底面积（㎝2）；t――暴露时间（min）。•目前，我国还没有统一的空气卫生标准，一般以室内1m3空气中细菌总数在500～1000以上作为污染指标。AtNC501000