2分子杂交

转基因水稻外源基因拷贝数检测第二部分：分子杂交SouthernBlottingDNA抽提DNA酶切酶切产物电泳转膜烘膜预杂交探针准备及标记杂交洗膜/显影1212345679(kb)12335转基因植物拷贝数检测实验原理酶切、转膜杂交、显影不同位置的插入拷贝产生不同大小的杂交带！HprobeHindIIIHHH1212345679(kb)12335显影后的杂交结果示意图植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法）1.保证核酸一级结构的完整性（30－50Kb）；2.排除其它分子的污染。1.不存在对工具酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；2.其它生物大分子的污染应降到最低程度。DNA纯化的要求分离纯化核酸总的原则CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种非离子去污剂，CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。CTAB法原理操作步骤1.采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；2.取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95ºC以上的1.5CTAB，混匀；3.65ºC水浴中放置30分钟，每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性，促进内溶物释放)；4.12000rpm离心5-10分钟；5.吸取600l上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒至下层有机相呈深绿色；6.10000rpm离心5分钟；7.吸取450l上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇，上下颠倒至絮状沉淀出现；8.12000rpm离心10分钟；9.弃去上清。用1000l75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，弃上清,自然干燥；10.加入50lTE（含20g/mlRNaseA），放于25ºC溶解、待用。11.充分溶解后，测定浓度。1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-ME处理；2．研钵预冻，粉末转管前至加CTAB前不要融化；3．24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操作要在通风柜中进行；4．所用试剂必需灭菌，手套。思考：（1）试分析DNA降解的可能原因（2）提高DNA产量的措施本实验注意事项氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿是有机溶剂，去除植物色素、蛋白质和多糖等，异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效；DNA沉淀：无水或95％的乙醇，或异丙醇；3MNaAC(或10MNH4AC）协助乙醇沉淀DNA；75%乙醇去除微量Na+、K+、Mg2+等阳离子及小分子量的有机分子，洗脱CTAB。所用到的试剂及作用TE（1mMEDTA，10mMTris.HClpH8.0）溶解并长期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子，从而抑制DNase等的活性。1.5×CTABCTAB15g1MTris·Cl(pH8.0)75ml0.5MEDTA30mlNaCl61.4gAddddH2Oto1000ml外环境条件：pH8.0防止脱氨作用；65℃CTAB中DNase变性，促进内溶物释放；离心时15℃以防CTAB沉淀而降低DNA量。1.DNA纯度：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。2.电泳检测DNA大小：琼脂糖凝胶电泳DNA质量检测Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1µg/mlHoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1µg/ml，分析范围可延至15µg/ml，但会降低一定的灵敏度。缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。DNA的定量（1）荧光检测仪1OD＝50g/mlDS-DNA1OD＝40g/mlRNAorSS－DNA（2）分光光度计琼脂糖凝胶电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验原理影响DNA迁移速率的因素DNA分子大小：迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性DNA）琼脂糖浓度：logU=logU0Kr胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：0.5%：1-30kb0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb1.5%：0.2-3kb电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm；DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。碱基组成与温度：一般影响不大，4-30℃。嵌入染料的存在：降低迁移率，(不提倡加在电泳液中)电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动；离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）实验步骤1.用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2.调整好梳子的高度；3.称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；4.凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5.将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依次点入加样孔中；6.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；7.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种:溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。1.含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中2.含有电泳指示剂，以指示电泳的进程上样缓冲液实验室常用核酸染料•EB•GoldView•Gelred（UniRed）/Gelgreen•SybrgreenI•SybrGreenII（RNA）EB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000×贮存液(0.5mg/mL)，使用时按1：1000稀释配制染色液。EB的去除有特定的识别序列，通常为4－6碱基的回文对称序列；切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基团，3’末端有羟基；切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)两种；其活性发挥只需Mg2＋作辅酶。II类限制性内切酶的特点限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50µl反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1µg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的Star活性：限制酶在某些极端非标准条件下对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。高浓度的甘油（5％）；酶过量（100U/ug）；低离子强度（25mM）；高pH(pH8.0)；有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶对上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：注意1.注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了Buffer和作用的温度等；2.涉及到酶的操作时,一律在冰上操作；3.使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取；4.如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture再分装；5.各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心。检测DNA质量测量DNA浓度所有DNA样品的浓度调整到大致相同限制性内切酶操作准备：DNA(５g)7l10*bufferreaction2lEnzyme(10U)1l(10U/l)ddH2O10l20l酶切的一般体系：注意：冰上操作1×5×DNA7lHindIII(10U/µl)1l5l10×buffer2l10lddH2O10l50lTotal20l37°C酶切过夜本实验酶切体系混匀分装电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。•若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做。•出现切烂：DNA降解，重新提DNA；•切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。酶切效果检测A1优总DNAA2劣总DNAB1酶切烂B2酶切优B3切不动总DNA酶切电泳检测1212345679(kb)12335显影后的杂交结果酶切反应的终止1.加入终浓度为12.5mmol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应2.多数酶在65°C10分钟可被不可逆灭活，少数65°C不失活的酶在75°C15分钟也能失活3.若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化造成DNA酶切不完全的主要原因DNA问题：不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；被甲基化；酶切后DNA粘末端退火；识别位点的两侧插入了影响酶切效率的序列；操作不当：酶或DNA粘在管壁上，反应体系没完全混合；酶粘度大，取样不准或酶稀释不正确；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适;酶的问题：活力不够；强烈振荡使酶变性；过度稀释使酶活性降低等。DNA样品中抑制酶活的主要污染物DNA样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性。解决办法：1.增加酶作用的单位数（10-20U/µgDNA)；2.增大反应体积以稀释可能的抑制剂；3.延长反应时间；4.消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5mmol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物；5.纯化DNA。1.胶浓度0.7-0.8%。2.胶厚度5mm(250ml胶)，用1倍TAE配制。3.胶的均一性(不同样品的迁移率一致)。4.样品DNA量5.指示剂量稍大，长时间指示。6.点样顺序：marker，阳性对照，阴性对照，本组样品7.电泳电压：大电泳槽40V，12小时，1-1.5V/cm。8.电泳结束，指示剂约移动10-11cm。电泳转膜的方式：1.UpwardCapillaryTransfer(Figure1)2.DownwardCapillaryTransfer(Figure2)3.SimultaneousTransfertoTwoMembranes4.ElectrophoreticTransfer5.VacuumTra