2发酵工程菌种的来源.

吉林师范大学生命科学学院发酵工程课件FermentationEngineering第二章菌种的来源主讲人：程云清欢迎光临2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院2教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本特性和菌种的选育、种子扩大培养。教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点、地理和气候条件，土样的采集方法；生化反应分离法；种子扩大培养。第二章菌种的来源(4学时)2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院3内容速览2诱变育种2.2目的微生物的分离2.1工业化菌种的要求及介绍2.3菌种选育1自然选育2.4种子扩大培养2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院4一、工业化菌种的要求§1工业化菌种的要求及已工业化产品生产菌介绍能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；遗传性能要相对稳定；菌种改造的可操作性要强；抗噬菌体及杂菌污染能力强；产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；发酵条件如温度、pH、溶解氧、泡沫等易控制。2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院5放线菌（链霉素、四环素、红霉素等）真菌（青霉素、头孢菌素等）一些产芽孢的细菌（多黏菌素、丁胺菌素等）植物或动物来源（蒜素、番茄素、鱼素等）1、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：二、已工业化产品生产菌介绍2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院6初级代谢和次级代谢异同？1概念不同2产物不同3存在范围不同4对微生物的作用不同5同微生物生长过程的关系6对环境条件的敏感性或遗传稳定性上明显不同7相关酶的专一性不同8两者既有区别性又有连续性2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院7概念不同在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程，称为初级代谢而次级代谢是相对于初级代谢而提出的一个概念。一般认为，次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院8产物不同初级代谢的产物，即为初级代谢产物。如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生命必需物质。通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院9存在范围不同初级代谢的代谢系统、代谢途径和代谢产物在各类生物中都基本相同，它是一类普遍存在于各类微生物中的一种基本代谢类型。次级代谢只存在于某些微生物中，并且代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院10对微生物的作用不同通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。次级代谢产物一般对菌体自身的生命活动无明确功能，不参与细胞结构组成，也不是酶活性必需的，不是机体生长与繁殖所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍，也不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。但许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院112、氨基酸生产有关的微生物用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点。代谢控制发酵2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院12可以大量积累人工诱变的菌株不能合成反馈抑制不能合成人工诱变控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸P459高丝氨酸脱氢酶2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院13氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚；代谢途径比较简单。谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌。常规菌种一般是以谷氨酸生产菌选育而成；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，工程菌。2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院143、酶制剂生产有关的微生物利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产α—淀粉酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等；β-淀粉酶：米曲霉、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌等；纤维素酶：木霉、青霉；蛋白酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌等。返回2020年1月12日星期日15一、菌种分离的一般过程二、微生物材料的标本采集A、不同的土壤特点B、地理和气候条件C、微生物的生理特性D、极端环境条件下采样分离三、标本的预处理四、目的微生物富集的一些基本方法五、菌种分离§2自然界中目的微生物的分离2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院16一、菌种分离的一般过程P14标本采集→预处理→富集培养→菌种分离（初筛、复筛）→发酵性能鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大？如何在后续的操作中使这种可能性实现？目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：→菌种保藏返回2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院17遵循原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种一般通过以下途径获得菌种：①向菌种保藏机构索取有关菌株；②由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等；③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌。二、微生物材料的标本采集2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院18国内菌种保藏机构27ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心ISF中国农业科学院土壤肥料研究所SH上海市农业科学院食用菌研究所CACC抗菌素菌种保藏管理中心IA中国医学科学院抗菌素研究所SIA四川抗菌素工业研究所CGMCC普通微生物菌种保藏管理中心AS中国科学院微生物研究所AS-IV中国科学院武汉病毒研究所CFCC林业微生物菌种保藏管理中心CAF中国林业科学院菌种保藏管理中心CICC工业微生物菌种保藏管理中心IFFI轻工业部食品发酵工业科学研究所CMCC医学微生物菌种保藏管理中心ID中国医学科学院皮肤病研究所NICPB卫生部药品生物制品监察所IV中国医学科学院病毒研究所CVCC兽医微生物菌种保藏管理中心CIVBP中国兽医药品监察所YM云南省微生物研究所GIMCC广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心CCTCC中国典型培养物保藏中心CCDM华中农业大学菌种保藏中心CMBGCAS海洋微生物中心HKUCC香港大学保藏中心CUHK香港中文大学保藏中心BCRC台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院19国外菌种保藏机构ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美国典型菌种保藏中心NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技术评价研究所生物资源中心NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美国农业研究菌种保藏中心CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷兰微生物菌种保藏中心UKNCC(TheUnitedKingdomNationalCultureCollection)英国国家菌种保藏中心2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院20自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标。土样采集应注意以下问题：A、不同的土壤特点B、地理和气候条件C、微生物的生理特性D、极端环境条件下采样分离二、微生物材料的标本采集2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院21A、不同的土壤特点P15因土壤组成、有机物浓度、pH等条件的不同，微生物的种群分布会非常不同。如菜园和农田常以细菌和放线菌较多（偏碱）；果园树根土壤中酵母菌含量较高（偏酸）；动植物残骸及腐殖土中霉菌较多；根瘤菌多在豆科植物根系土壤中分离；分解石油的微生物常在油田和石油炼油厂附近的土层中分布最多。自然环境中的天然菌群，可因人类的生产或生活而改变。如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪），会导致放线菌群的增加；在杀真菌剂存在下，诺卡氏菌属的菌更容易分离到。2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院22B、地理和气候条件南方和北方，一年四季。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方。原因是南方温度高、温暖季节长、雨水多、相对湿度高、植被覆盖面广、土壤有机质丰富。冬季温度低气候干燥；春季温度开始回升但雨水较多；夏季天气炎热温度高；秋季采土样最为理想。采土样的方法：南方，用取样铲，将表层5cm（阳光直射，蒸发量大水分少，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院23C、微生物的生理特性筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；低温酶产生菌时，南北极地区、冰窑、深海；分离耐压菌则从深海底部采样，如Micrococcusaquivivus水活微球菌,耐600个大气压；分离耐高渗透压酵母菌时，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院24Ｄ、极端环境条件下采样分离极端微生物的采集。高热、高压、低温、强碱、强酸及高渗透压等返回2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院25三、标本的预处理提高菌种分离的效率●物理方法：加热(55℃,6min；100℃,1h；40℃2-6h)、膜过滤法、离心法、空气搅拌法●化学方法：含1%几丁质培养基、用CaCO3提高pH值进行培养（链霉菌属）●诱饵法：用涂石蜡的棒置于碳源培养基中（诺卡氏菌）、花粉（游动放线菌）、蛇皮（小瓶菌属）、人头发（角质菌属）2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院26小瓶菌属放线菌目、游动放线菌科的一属。已记述约10个种。代表种为规则小瓶菌。形态特征：一般无气生菌丝，基内菌丝上层栅栏状菌丝或孢囊柄顶端着生瓶状、简形、铃状或略不规则的孢囊，其中有大量呈平行直线排列的杆状孢囊孢子；孢囊孢子大部具极生鞭毛，能游动；细胞壁化学组分Ⅱ型，即以内消旋二氨基庚二酸和甘氨酸为特征组分；DNA中的G+C克分子含量为72.3％。返回2020年1月12日星期日吉林师范大学生命科学学院27富集的基本方法：1、控制营养：如以唯一碳源或氮源作底物；2、控制培养条件：如pH、温度、通气量等；3、抑制不需要的种类。四、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所