2核酸的分离纯化

第二章核酸的分离纯化•DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象•DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作核酸分离纯化的原则:•保持核酸一级结构的完整性•尽可能提高核酸制品的纯度核酸分子提取的技术路线I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第一节核酸分离纯化的设计及原则第二节基因组DNA的分离纯化第三节质粒DNA的提取与纯化第四节RNA的分离纯化第五节核酸的保存与鉴定第一节核酸分离纯化的设计及原则一、材料与方法的选择二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存（一）材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。•需考虑制备核酸所需的时间与成本•应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择1.保持核酸碱基序列的完整性2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度3.保持核酸的完整性尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（二）选择原则一、材料与方法的选择二、技术路线的设计（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（一）核酸的释放DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。应该清除的杂质主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等2.非需要的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质3.加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤•沉淀是浓缩核酸最常用的方法•常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁•常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇•核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定2.纯度鉴定3.完整性鉴定紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。1.浓度鉴定各种碱基的紫外吸收光谱荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。EB与DNA的结合紫外分光光度法：主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。2.纯度鉴定1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0荧光光度法：EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。琼脂糖凝胶电泳：•以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性•基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状3.完整性鉴定DNA的降解完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。•沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高•沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低•28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解•若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染（二）核酸的保存1.DNA的储存2.RNA的储存溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时DNA易变性。1.DNA的保存2.RNA的保存•RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃保存•RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间•用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理第二节真核基因组DNA的分离纯化生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线基因组DNA的提取---酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒细菌基因组DNA试剂盒细胞基因组DNA试剂盒一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收一、酚抽提法•1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法•以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞•经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品二、甲酰胺解聚法1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。三、玻棒缠绕法玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来四、其它方法有些分子诊断技术并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法广泛使用。1.异丙醇沉淀法2.玻璃珠吸附法五、DNA片段的纯化常用的纯化方法：有机溶剂抽提法柱层析法（columnchromatography）六、DNA片段的回收原则与要求:1.提高片段的回收率2.清除回收的DNA样品中的杂质（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。第三节质粒DNA的提取与纯化•质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。•质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。质粒特性1.分子相对小2.含有高效的自主复制成分3.不相容性4.转移性5.选择的标记6.限制性内切酶单一切。质粒DNA的提取和纯化1．细菌的培养先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。质粒DNA的小量制备2-5ml质粒DNA的大量制备500ml{2．细菌的收集•细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净碱裂解法煮沸法SDS裂解法Triton-溶菌酶法3．细菌的裂解方法4．质粒DNA的提取---适用于大质粒DNA---不适宜含糖高的菌株如HB101二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其他方法一、碱裂解法五、质粒DNA的纯化一、碱裂解法在强碱（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。•细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物•当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构•在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中二、煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。•质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构•通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA三、SDS裂解法•将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁•用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中•用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA由于条件温和，SDS裂解法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但由于部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。四、其他方法（二）牙签少量制备法(一)小量一步提取法•直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA•简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析(一)小量一步提取法（二）牙签少量制备法•用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA•由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定五、质粒DNA的纯化１.CsCl-EB法２.聚乙二醇沉淀法３.柱层析法在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。•蛋白质由于密度小而浮于液面•RNA密度大而沉于管底•各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部EB-CsCl密度梯度离心法不同分子构型的DNA与EB的结合能力不同，密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。•染色体DNA、开环质粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降较多•闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入而结合量少，密度下降较少第四节真核细胞RNA的分离纯化细胞RNA的含量每个细胞的RNA量约为10-5μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法三、商品化试剂单相裂解法四、mRNA的分离纯化一、RNA制备的条件与环境一、RNA制备的条件与环境•RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中•RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复•去除RNase的污染和抑制其活性是RNA制备成功与否的关键•在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活细胞内RNase的活性•选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）•使用蛋白酶K•使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠•联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解•加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法•以含异硫氰酸胍、β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞•在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液•通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA总RNA产量取决于标本的起始量，每mg组织大约能制备4～7µg总RNA，每106个细胞大约能制备4～10µg总RNA。三、商品化试剂单相裂解法•是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案•以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相•变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来•保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备目前，该法已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法相当。四、mRNA的分离纯化•除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3´末端带有长短不同的poly（A）尾巴•利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA1.oligo（dT）-纤维素柱层析法2.oligo（dT）-纤维素柱离心法3.oligo（dT）-纤维素液相结合离心法4.磁珠分离法5´m7GAAAAAAAAAAAA3´3´TTTTTTTTTTTT-Biotin5´+总RNA中的poly(A)+RNA分子退火形成杂交体5´m7GAAAAAAAAAAAA3´3´TTTTTTTTTTTT-Biotin5´链亲和素标记的磁珠+Streptavidin-磁5´m7GAAAAAAAAAAAA3´3´TTTTTTTTTTTT-Biotin5´St