环境样品中微生物的纯种分离

1环环境境微微生生物物实实验验中国海洋大学环境科学与工程学院2008.05.012目录实验一培养基的制备及灭菌…………………………………2实验二环境样品中微生物的纯种分离、培养和接种技术…4实验三显微镜的操作和细菌的染色及其形态观察…………9实验四显微镜测微技术及微生物的直接计数实验五细菌生长曲线的测定实验六环境中细菌菌落总数的测定…………………………8实验七水体中大肠菌群的测定实验八微型浮游植物和浮游动物的培养和计数实验九活性污泥样品采集及生物活性的检测3实验一培养基的制备及灭菌一、实验目的1.明确培养基的配制原理，掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.掌握高压蒸气灭菌的基本原理、基本方法和应用范围。二、基本原理(牛肉膏蛋白胨培养基)培养基制备：牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨培和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时融化，在40℃时凝固，通常不被微生物分解和利用。微生物的生长繁殖除需要一定的营养物质外，还需要适当的pH范围，不同微生物对pH要求不同，霉菌和酵母菌培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌培养基的pH为中性或微碱性，所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到适当的范围，以利于微生物的生长和繁殖。此外，由于配制培养基的各成分和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必需立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而带来不利的影响。灭菌：消毒与灭菌两者的意义有所不同，消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。加热法又分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭菌有火焰烧灼和热空气（常用烘箱）灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等，在热空气160-170℃下保温2小时进行灭菌。湿热灭菌有高压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒法。高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧的将锅内的冷空气从排气阀中驱进，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀伤力比干热大。原因有三：一是湿热中的细菌吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热得穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的能量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌的效力。4使用高压蒸气灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当灭菌锅内含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。一般培养基用0.1Mpa，121.5℃，15-30Min可达到彻底灭菌的目的。灭菌温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa，112.6℃灭菌15Min，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3℃，20Min灭菌，然后以无菌操作手续加灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa，121.5℃灭菌20Min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30Min。三、操作步骤牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂粉15-20g（不加琼脂粉为液体培养基），水1000ml，pH7.4-7.61.称量按培养基的配方比例依次准确称量牛肉膏、蛋白胨、Nacl溶于蒸馏水中。（*配制培养基时，不可用铜锅或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基，影响细菌生长。）2.调节pH用NaoH调节pH至7.4—7.6。PH调节不应过头，以便影响培养基中各离子的浓度。配制低pH的琼脂培养基的时候，若预先调节好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固因此培养基成分应和琼脂成分分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH值。3.加热溶解将以上溶液加热，边搅拌边加入称量好的琼脂，继续加热溶化。在琼脂加热过程中应控制火力，以防培养基沸腾而溢出容器。同时应不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。4.分装（1）试管斜面培养基每组分装试管12支，分装试管以试管高度的1/3为宜。（若要分装液体培养基，分装高度以试管高度的1/4为宜。）(2)余培养基倒入葡萄糖瓶，加绳（通气）加塞，灭菌后倒平板。5.灭菌培养基在0.103Mpa、121.3℃高压蒸汽灭菌20Min。（将全部试管外面包一层牛皮纸，用麻绳捆好，做好标记，然后灭菌。葡萄糖瓶中的培养基做好标记后可直接灭菌。）步骤如下：(1)加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。(2)装入待灭菌物品。注意不要装的太挤，以防阻碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，一面冷凝水淋湿包口的纸而进入。(3)加盖，旋紧螺栓，并将盖上的排气阀打开，以排除锅内的冷空气，(4)打开电源，设置温度和时间，开始灭菌。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20Min5灭菌。(5）待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随压力增加而逐渐上升。当锅内的压力上升到所需压力后，按照设定的时间，维持压力20Min。(6)灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅的温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意：压力一定要降到“0”时才能打开排气阀，开盖取物。否则会因锅内压力突然下降，而是容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成沾染，甚至灼伤操作者。6.搁置试管斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻璃棒或其他合适的高度的器具上，搁置斜面的高度以不超过试管总长度的一半为宜。7.平板的制作将葡萄糖瓶中的培养基灭菌后，冷却至50℃左右，然后倒平板。其方法是：右手持盛培养基的玻璃瓶，置火焰旁，左手拿平板并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如培养基可一次用完，则瓶塞不必夹在手指中。瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后既成平板。8无菌检查将灭菌培养基放在37摄氏度的室温中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。9.其他配置0.85％的生理盐水，为下一步实验做好准备。将配好的生理盐水分装至大试管内，每管分装9ml，灭菌。若下一步微生物纯种分离实验以固体样品为菌源，则需准备90ml生理盐水，分装如带玻璃珠的三角瓶中，一起灭菌。准备下一步实验需要的采样瓶（广口瓶）、长吸管、移液管（1ml）5支，分别包装，灭菌。四、思考1.培养微生物的培养基应具备那些条件，为什么？2.培养基配好后为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基无菌？3.高压蒸汽灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完后，为什么要待压力降至0才能打开排气阀，开盖取物？6实验二环境样品中微生物的纯种分离、培养及接种技术一、目的要求1.了解分离纯化微生物的原则，掌握纯种分离的方法2.掌握微生物的常规接种技术二、基本原理自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养。这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。常用的分离方法有平板稀释法和平板划线法等，最终使单个微生物细胞在固体培养基上生长而形成单个菌落，从而获得若干种细菌的纯培养。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，然后分离纯化该微生物，直至得到纯菌株。三、操作步骤1．样品采集小组成员自己选择采取感兴趣的样品，作为分离纯化的菌源。2．样品稀释取三个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样加入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。若为土样等固体样品，称取10g土样，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，充分混匀，然后按照以上方法依次稀释三次。3.平板接种稀释涂布平板法自最后三个稀释度的试管中各取稀释菌液0.2ml，于相应标记的平板中央，用玻璃涂棒在平板表面涂布均匀。每一稀释度做三个培养皿。稀释混合平板法自最后三个稀释度的试管中各取1ml稀释菌液加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做三个培养皿。按照以上倒平板的方法，各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即摇匀。4.细菌培养倒置于37℃恒温培养箱中培养2－3天，使菌落性状表现较充分。5．平板划线分离(1)在火焰上灼烧接种环7(2)挑菌：在近火焰处，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，冷却后，挑取我们所需菌落（本实验选择优势菌）。(3)划线：按照同样的方法在近火焰处拿起另一空白平板培养基，在平板上轻轻划线（切勿划破培养基），方法参见图2-1、2-2、2-3，划线完毕盖好皿盖。(4)培养：将平板倒置于37℃培养箱中培养。图2-1图2-2图2-36.试管斜面接种将以上操作获得的细菌的纯培养接种到斜面培养基上，为进一步对单菌株进行研究做好准备。平板——斜面(1)挑菌：按照以上方法从平板上挑取单克隆；(2)划线：放下平板，左手拿起试管斜面，在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住试管帽，拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉，然后将带菌的接种环伸入试管底部，在斜面上由底部向上划曲线；划至斜面的顶端，抽出接种环，扣上试管帽，并将试管放在试管架上，最后再次烧红接种环，除掉接种环上剩余的菌，以防污染环境。(3)培养:将试管斜面置于37℃培养箱中培养。斜面——斜面(1)将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指押住两支试管，中指位于两支试管中间，斜面向上，管口齐平。(2)右手先将试管帽松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红以达到灭菌的目的（环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧）；在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住两个试管帽，同时拔出。(3)试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉。将烧过的接种环伸入管内，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出试管外迅速伸入另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，扣上试管帽，并将试管放在试管架上，最后再次烧红接种环，除掉接种环上剩余的菌，以防污染环境。四、结果报告小组成员对微生物分离、培养及接种技术的掌握程度如何？实验结果是否有问题？五、思考1.在恒温培养箱中培养微生物时为何将平板倒置？82.在平板划线分离时，为什么每次都要将接种环上剩余物烧掉？五、注意事项用于涂布的平板，应尽量减少培养基表面的冷凝水，以免菌落扩散、蔓延成一片菌苔。附：微生物保藏技术一、目的要求掌握常用的微生物菌种保藏方法二、基本原理菌种的长期宝藏是一切微生物工作的基础，菌种保藏的目的是使菌种被保藏后不死亡、不变异、不污染，并保持优良性状，微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，