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第二章工业微生物的生长与产物的生物合成第一节微生物的生长与分化第二节代谢产物的生源说与生物合成第三节微生物生物合成的主要调控机制微生物的五大特性：1.体积小，面积大；2.吸收多，转化快；3.生长旺，繁殖快；4.适应强，易变异；5.分布广，种类多。从中发现我们需要的物质的可能性大，易于工业化发酵。第一节微生物的生长与分化一、微生物的生长繁殖生长和繁殖是实现微生物生理功能的基础；是进行大规模发酵过程的前提。生长：细胞代谢过程中，同化作用的速度超过异化作用，原生质总量不断增加。繁殖：细胞分裂而出现细胞个体数目的增加。不同微生物的繁殖方式：细菌——无性二等分分裂法；放线菌——分生孢子或菌丝断裂；霉菌——无性孢子、有性孢子或菌丝断裂；酵母——无性繁殖(芽殖、裂殖)和有性繁殖(子囊孢子)。二、微生物的生长曲线微生物的生长曲线:在适宜的新鲜培养基中接入少量细菌（或其他微生物），以后每隔一定时间取样测细菌数目。以细胞群体量的对数对培养时间作图，可绘制出细胞群体量随培养时间的变化曲线。它代表细菌从生长开始到自溶死亡的整个动态过程。从曲线可区分为延滞期(适应期)；对数生长期；稳定期(平衡期)；对数死亡期。一条典型的生长曲线至少可以分为：迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期微生物分批培养生长繁殖的规律：延滞期(适应期)：菌体数目不变或略有降低，菌体生长速率为零，单个细胞体积和质量增加。对数生长期：菌体开始生长，细胞数目以几何级数增加，细胞的代谢极其旺盛。稳定期(平衡期)：细胞数量达到最大，细胞的生长速率与死亡速率达到动态平衡。对数死亡期：营养物质消耗殆尽，代谢物大量积累，菌体产生毒性，造成细胞迅速死亡。三、微生物细胞的分化微生物细胞的分化：指从营养菌丝产生不同形态类型细胞的过程。包括：①菌体营养细胞的分化：仅从一种营养菌体分化为另一种形态的营养菌体；②孢子的形成：在某些条件下，营养菌体可分化为内生孢子或外生孢子等特殊的细胞类型；细胞的分化受到遗传性和环境因素的控制。①菌体营养细胞的分化指营养菌体——其他形态的营养菌体如成晶节杆菌在葡萄糖-盐培养基上生长时，它的细胞呈球状，培养基中加入蛋白胨或氨基酸(精氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸)时，菌体呈杆状，同时生长速率加快。①杆状体的肽聚糖具有更多的交联；②球状体细胞壁肽聚糖的肽键之间的连接物有甘氨酸，杆状体细胞没有；③球状体肽聚糖的多糖主干长度为20nm，而杆状体细胞多糖主干长度为球状体的3倍。再如鲁氏毛霉：在正常培养条件下进行菌丝型生长----假丝酵母，在培养环境中CO2达一定浓度或培养基中己糖达一定浓度时，菌体被诱导成带芽的球状酵母型细胞。实验证明，毛霉生长时，菌体形态的变化与细胞壁结构有关。酵母型菌体细胞壁所含的甘露聚糖比菌丝型菌体高6倍。②孢子的形成许多微生物在营养条件不良的情况下，能够形成对环境具有较大抵抗力的细胞结构或孢子。各种微生物所形成的孢子结构差异较大，但对孢子的结构至今研究得不深入。研究比较清楚的有：芽孢杆菌的内生孢子、啤酒酵母的子囊孢子和曲霉菌的分生孢子。（形成过程参考课本）第二节代谢产物的生源说与生物合成微生物的代谢产物按与微生物生长繁殖的关系，可分为两大类：初级代谢产物和次级代谢产物。初级代谢产物：微生物代谢产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。如氨基酸、核苷酸等。次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构比较复杂、对微生物无明显生理功能或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。如抗生素、生物碱等。相同点：微生物代谢产生。在基因指导下，微生物细胞总体调控下有序地产生。不同点：初级代谢产物是微生物自身生长繁殖所必需的，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖、核酸等。它们的生源和生物合成过程在各种微生物体内基本相同。次级代谢产物与菌体的生长繁殖无明确关系，如抗生素、生物碱、色素等。它们的生物合成有种特异性。初级代谢产物和次级代谢产物的不同初级代谢产物次级代谢产物生长繁殖是否必需是否产生阶段始终产生生长到一定阶段后产生菌种特异性无有分布位置细胞内细胞内或细胞外种类氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素激素、毒素、色素、抗生素一、微生物合成的初级代谢产物初级代谢产物如氨基酸、核苷酸、脂肪酸、维生素、蛋白质、酶类、多糖、低级有机酸和醇等均已被分离精制成为医药用品，开发的品种也日益增加。（Vc、木糖醇）生产上述产物的微生物都是代谢失调的突变菌株，如营养缺陷型、抗性变株、生化调节变株等。微生物本身，在漫长的进化过程中，已达到适合于它生存和繁衍的水平。野生型微生物经自然选择，能适应它的周围环境，也能适应同其它物种的竞争，但却不能按人们的意志生产他们需要的物质。因此，从人类的利益出发，须对工业微生物育种进行改良，使微生物产生数量远远超出其本身需要的物质，或者产生不是它正常代谢产生的新物质。(理解，阐述)二、微生物合成次级代谢产物的基本特征(一)次级代谢产物具有种特异性分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌，既能合成链霉素，又能合成多烯大环内酯类的杀假丝菌素；分类学上不同的菌种也能产生相同的抗生素，如能产生头孢菌素C的菌有霉菌和链霉菌。(二)分批发酵时，产生菌生长周期分为三个时期菌体生长期、产物合成期以及菌体自溶期。(三)次级代谢产物不少是结构相似的混合物一种菌可产生结构相近的一族抗生素，原因是：①参与次级代谢产物合成的酶系的底物特异性不强，如产黄青霉菌能合成五种以上的青霉素(G、V、O、F、X)；不同的侧链构成不同的药物。青霉素钠的侧链为一苄基，母核上的羧基成钠盐，以增加药物水溶性。氨苄西林也属青霉素类药物，其侧链为α-氨基取代的苯乙酰基。阿维菌素有八个有效组分。②产生菌利用一种或两种以上初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物后，继续对该产物进行多种化学修饰而同时合成多种衍生物。此现象称为“代谢树”，如利福霉素多种组分的生物合成过程；③一种次级代谢产物可由两种或两种以上的代谢途径合成，这种方式有时称为“代谢网”，如红霉素A的生物合成。(四)次级代谢产物的合成受多基因控制控制次级代谢产物合成的基因有的在染色体上，有的在质粒上，有的两者都有作用。若干试验表明，质粒在次级代谢产物合成中起着重要的作用。在深层(或沉没)培养中，由于环境的作用，质粒易丢失或丧失其功能，导致次级代谢的不稳定性。（基因工程菌）三、次级代谢产物的构建单位的生源说和生物合成生源说指的是代谢产物分子中构建单位的各种原子的起源；(有机化学)(C源、N源)生物合成指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级代谢产物的过程。(生物化学)根据生源，微生物次级代谢产物分为五种类型：A.由糖或糖的衍生物为前体合成的次级代谢产物，如曲酸、链霉素及大环内酯抗生素中的糖苷、氯霉素、新霉素、嘌呤霉素等；B.氨基酸为前体的的次级代谢产物，如环丝氨酸、6-氨基青霉烷酸、杆菌肽、放线菌素等；C.通过乙酸-丙二酸聚合途径合成的次级代谢产物，如四环素、红霉素、放线菌酮、利福霉素等；D.通过莽草酸或分支酸合成的次级代谢产物，如新生霉素、氯霉素、绿脓菌素等；E.通过甲羟戊酸与异戊二烯聚合途径合成的次级代谢产物，如赤霉素、类固醇、麦角甾醇等。链霉素的结构有链霉胍和链霉二糖胺两部分,后者由链霉糖和2-甲氨基葡萄糖构成。杆菌肽则由His、Asp、Asn、Lys、Glu、Leu、Ile、Phe、Orn（鸟氨酸）等多种氨基酸合成。6-氨基青霉烷酸的合成离不开半胱氨酸的参与。1.前体及其来源前体是加入到发酵培养基中的某些化合物，能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，他们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。前体与中间体的区别在于前者的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中去，有时它们是指同一物质。前体来源：微生物次级代谢产物大多源自一些关键初级代谢物，它们是初级代谢产物中间体，可作为次级代谢物的前体：糖类，莽草酸和芳香氨基酸，非芳香氨基酸，C1化合物(甲基)，脂肪酸(尤其是乙酸和丙酸)，柠檬酸循环的中间体，嘌呤和嘧啶。可作为次级代谢物前体的物质Betina认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的中间体：糖类莽草酸/或芳香氨基酸非芳香氨基酸C1化合物脂肪酸柠檬酸循环中间体嘌呤和嘧啶Martin等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中间体分为：短链脂肪酸异戊二烯单位氨基酸糖与氨基糖环乙醇与氨基环己醇脒基嘌呤与嘧啶碱芳香中间体与芳香氨基酸甲基内源前体的来源(1)短链脂肪酸----大环内酯类抗生素乙酸CoA丙酸CoA丁酸CoA目前，沿用的大环内酯类有红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白霉素。异戊二烯单位可参与萜和一些抗生素的合成，如真菌代谢物、动植物和真菌的甾类化合物和萜的形成。木霉素、羧链孢酸、新生霉素（2）异戊二烯单位正常氨基酸和经过修饰的非蛋白氨基酸可用于合成同型肽类抗生素。有些次级代谢物含有不寻常的氨基酸（3）经修饰的氨基酸－－构筑同型肽类抗生素（4）芳香中间体－－－抗生素的芳香部分A莽草酸途径的中间体或终产物：形成许多次级代谢物的芳香部分。B芳香氨基酸生物合成途径：负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成。C聚多酮途径：大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚多酮途径合成的。糖的碳架以整体的方式结合到抗生素，但是在结合前需要经过差向异构化、异构化、氧化、去羟基、重排等环节。（5）经修饰的糖与氨基酸链霉素、庆大霉素、新霉素和卡那霉素（6）环己醇与氨基环己醇（7）脒基和甲基甲基的来源抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以Met作为甲基供体，通过甲基转移酶进行。而Met的甲基源自N5-四氢叶酸。转甲基时Met先活化，即在Mg2+和ATP存在下生成高能甲基供体：S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以SAM进行甲基化后自己变成S-腺苷酰高半胱氨酸(SAH)，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。核糖部分或嘌呤或嘧啶部分被修饰。含有正常的核苷的抗生素，例如（狭霉素C以及蛹虫草菌素），或者核糖部分或嘌呤或嘧啶部分被修饰。（8）经修饰的嘌呤和嘧啶碱青霉素G前体：苯乙酸、苯乙胺、苯乙酰胺、苯乙酰苷氨酸头孢菌素前体－－－与青霉素基本相似红霉素簇前体－－－丙酸螺旋霉素前体－－－乙酸、丙酸、丁酸麦迪霉素前体－－－丙酰CoA环孢菌素前体－－－氨基酸氨基糖苷类抗生素前体－－－N－乙酰葡糖胺、N－乙酰胞壁酸外源前体的来源2.前体的作用前体可以直接构建次级代谢产物，也可以经微生物修饰后作为特殊前体，包括：聚酮体，甲羟戊酸，糖类和氨基糖，不常见的氨基酸，环多醇和氨基环多醇，非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱。前体可以起次级代谢物构建材料的作用，还可以诱导次级代谢物的合成。研究适当的前体添加策略对有些次级代谢物的高产稳产有重要意义。（1）抗生素建筑材料例如：丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等的合成，是几种肽类抗生素（头孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要中间体。次级代谢物通常由初级中间体产生，将初级中间体转化为次级终产物有三个生化过程：①生物氧化和还原；②生物甲基化；③生物卤化。许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的。（2）诱导抗生素生物合成在细胞中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下，细胞可利用的前体浓度具有调节抗生素生产的作用。例如：缬氨酸是头孢菌素A的前体物质和诱导物质。四、次级代谢产物生物合成的基本过程步骤：养分的摄入；（淀粉等）通过中枢代谢途径养分转化为中间体；（葡萄糖等）小分子建筑单位(前体)的生物合成；（木酮糖）如有必要，改变其中的一些中间体；（木糖）这些前体进入次级代谢物生物合成的专有途径；在次级代谢的主要骨架形成后做最后的修饰，成为产物。（木糖醇）四、次级代谢产物生物合成的基本过程步骤：养分的摄入；（蛋白胨等）通过中枢代谢途径养分转化为中间体；（氨基酸等）小分子建筑单位(前体)的生物合成；（His、Asp、Asn、L