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第三节蛋白质的分子结构•蛋白质是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。•蛋白质的结构是指，蛋白质分子中所含的多肽链的数目，肽链的交联，每条肽链的氨基酸的组成和排列顺序，以及整个蛋白质分子中各个原子和基团在空间的排布。蛋白质的结构分成四种层次:由氨基酸序列的一级结构开始，先卷绕成几种固定的二级结构，若干二级结构再组合成完整的三级结构，成为蛋白质的一个分子。三级结构已经是蛋白质的独立单位，可以具有其生物活性；但有些蛋白质分子，可以再次聚合若干其它的单元分子成为聚合体，进而形成四级结构，有更复杂的调节功能。一级结构(primarystructure)共价结构二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)蛋白质的分子结构高级结构蛋白质的共价结构有时称为蛋白质的一级结构，但多数场合把蛋白质的一级结构看成是氨基酸序列的同义词。一、肽、肽键和肽链1.肽是氨基酸的线性聚合物，因此也常称作肽链（peptidechain）。蛋白质是由一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成的大分子。除蛋白质外，蛋白质的部分水解产物和生物体内游离存在的一些激素和抗生素也是多肽。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。现在公认多肽和蛋白质分子中AA连接的基本方式是肽键一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩水形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。-CO-NH-3.肽(peptide)一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的化合物，称为肽。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽，其中含有1个肽键。含3个氨基酸残基的，称为三肽。含4个氨基酸残基的，称为四肽。依此类推几个十几个AA残基，称为寡肽（oligopeptide）更长的，称为多肽（polypeptide）肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成已经不是一个完整的分子，因此称为氨基酸残基。多肽链中的骨干是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽键部分和-C原子规则地重复排列而成，称为共价主链。R基部分，称为侧链。一条多肽链的主链通常在一端含有一个游离的末端氨基，这一端称为氨基末端（N末端）；另一端含有一个游离的末端羧基，称为羧基末端（C末端）。多肽链的结构具有方向性。在体内合成多肽或蛋白质时，是从氨基端开始，延长到羧基端结束。因此，N末端被定为多肽链的头，多肽链结构的书写通常是N端写在左边，C端写在右边。多肽链结构的命名也是从N端到C端，根据参与其组成的AA残基确定。下面的五肽可简写为Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu简单蛋白质AAaa残基的数目＝蛋白分子量／110因为，AA残基的平均分子量＝128－18＝110。2.天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。•动植物细胞中都含有一种三肽，称还原型谷胱甘肽（reducedglutathione）即γ－谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，因为它含有游离的SH基，所以常用GSH来表示。GSH的作用解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-ValL-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine,缩写为Orn）。鹅膏蕈碱的化学结构二、一级结构（Primarystructure）也称共价结构，基本结构，1°结构。维系一级结构的主要化学键是肽键和二硫键一级结构：多肽链的氨基酸序列（IUPAC规定）组成蛋白质分子中的多肽链的数目，每条多肽链的氨基酸的组成和排列顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。蛋白质的一级结构是基础，决定了蛋白质的空间结构。一级结构的阅读顺序是从N端到C端蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。SequenceofInsulin英国科学家FredSanger测定出了胰岛素的氨基酸序列（长度为51个氨基酸），获得1958年诺贝尔化学奖。Insulinconsistsoftwopolypeptidechains,AandB,heldtogetherbytwodisulfidebonds.TheAchainhas21residuesandtheBchainhas30residues.牛胰岛素一级结构1.样品必需纯（97%以上）；2.知道蛋白质的分子量；3.知道蛋白质由几个亚基组成；4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。（一）测定蛋白质的一级结构的要求（二）蛋白质测序的策略（九个步骤）1.测定蛋白质分子中多肽链的数目2.如果蛋白质分子有一条以上的多肽链构成，则这些链必须予以拆分。3.断开多肽链内的二硫桥4.分析每一条多肽链的AA组成5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基氨基酸序列测定中不包括辅基成分分析，但是它也应属于蛋白质化学结构内容。6.把多肽链裂解成较小的肽段7.测定各肽段的AA序列8.把各小肽段拼接重组成完整的多肽链序列9.确定半胱氨酸残基间形成的二硫桥位置（三）测定步骤1.N－末端和C－末端氨基酸残基的鉴定通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量，即可确定多肽链的数目。蛋白质摩尔数与末端AA残基摩尔数相等，说明蛋白质只含一条多肽链。末端AA残基摩尔数是蛋白质摩尔数的倍数，说明蛋白质分子是由多条多肽链组成。如果检测到的末端AA残基多于一种，说明蛋白质是由两条或多条不同的肽链组成。(1)N－末端分析①二硝基氟苯法（DNFBorFDNB法）：→称Sanger试剂2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色的DNP-氨基酸，用有机溶剂抽提后，通过层析可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N-末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸②丹磺酰氯（DNS）法DNS：是二甲氨基萘磺酰氯的简称。原理：与DNFB相同优点：丹磺酰基具强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍;丹磺酰基氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP-氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸多肽or蛋白质末端NH2＋PITC(Edman试剂)↓PTC－多肽or蛋白质↓有机溶剂┌－－－－－－N末端的PTC－AA发生环化∣生成苯乙内酰硫脲的衍生物∣↓∣剩余肽链∣除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。↓（因为，PTC的引入，只使第一个肽键稳定性降低）干燥/∣\薄层气相HPLC层析色谱③苯异硫氰酸酯（PITC）法：④氨肽酶法：性质：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。常用的是：亮氨酸氨肽酶（LAP）不是只能水解以Leu为N末端的肽键，只是水解以Leu为N末端的肽键速度最大N末端残基的氨基封闭情况：N末端是焦谷AA残基焦谷氨酸不能用Edman降解法（层析法鉴定）测定顺序（2）C末端测定法①肼解法蛋白质or多肽＋无水肼↓△肼解↙↘C末端aa以其他aa转变为游离形式存在相应的aa酰肼化物↓↓＋苯甲醛存在于上清液中二苯基衍生物（沉淀）↓DNFB、DNS、层析法。缺点：谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱aa破坏不易测出,C末端的Arg→鸟aa氨基酸酰肼可以与苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀GlnAsnCys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸②还原法：肽链C末端AA↓硼氢化锂α－氨基醇↓水解氨基醇＋aa↓层析法鉴别氨基醇种类③羧肽酶法：最有效，最常用的测C端残基方法性质：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能专一的从多肽链的C-端逐个的水解，释放出游离AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。常用4种羧肽酶：A－－胰脏――能释放除Pro,Arg,Lys之外所有C末端残基B－－胰脏――只能水解以Arg,Lys为C末端的肽键C――柑橘叶――水解C末端的ProY――面包酵母――能释放所有C末端残基2.多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如：血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理，即可分开多肽链(亚基)。如果多肽链间通过二硫键交联，如：胰岛素（含两条肽链）、-胰凝乳蛋白酶（含三条多肽链），可用氧化剂或还原剂将二硫键断裂。3.二硫桥的断裂-为防止重新形成二硫桥,随后要用烷基化试剂对还原时生成的－SH加以保护：如碘乙酸、苄氧酰氯。二硫键的断裂氧化法：过氧甲酸还原法：巯基化合物还原β-巯基乙醇（β-ME），二硫苏糖醇（DTT）等过氧甲酸β-巯基乙醇碘乙酸3-溴代丙胺4.氨基酸组成的分析蛋白质水解法：110℃酸水解：6MHCl－－→水解10－24h－→水解后除去HCl真空充氮安瓿瓶所得aa不消旋；但是色氨酸被破坏，丝AA、苏AA、酪AA被部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来，生成AA＋NH3，由水解液中的氨量可求出蛋白质的酰胺基总量。辅以碱水解。碱水解：色AA能定量回收AA被破坏110℃5MNaOH－－－→20h真空或充氮蛋白质的AA组成：用每mol蛋白质中含AA残基的mol表示或用每100g蛋白质中含AA的克数表示5.多肽的部分断裂和肽段混合物的分离纯化目前用于序列分析的方法一次能测出的序列都不太长，一般一次只能测几十个残基。所以目前对大分子多肽或蛋白质的AA顺序测定方法是：先将大分子多肽裂解为小的肽段，然后分离纯化，分别测定每一小肽段的AA序列。裂解时要求断裂点少，专一性强，反应产率高。(1)酶裂解法常用的蛋白水解酶（蛋白酶）：胰蛋白酶、糜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶，以及几种近年来发现的蛋白酶。这些蛋白酶都是肽链内切酶①胰蛋白酶：这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)残基的羧基参与形成的肽键。②糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：专一性不如胰蛋白酶断裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽键断裂点邻近的基团碱性：裂解能力↑酸性：裂解能力↓③嗜热菌蛋白酶└→含Zn.Ca↙↘活力必需的热稳定有关专一性差，常用于断裂较短的多肽链or大肽段④胃蛋白酶专一性与糜蛋白酶类似要求被断裂键两侧的残基都是疏水性AA如phe-Phe最适pH=2，二硫键在酸性条件下稳定，可用来确定二硫键的位置⑤金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）条件1：磷酸缓冲液pH7.8能在谷AA残基和天冬AA残基的羧基端断裂肽键条件2：碳酸氢铵缓冲液pH7.8醋酸铵缓冲液pH4.0只能断裂谷AA残基的羧基侧肽键⑥梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）专门