3+DNA的复制.

ThereplicationofDNADNA的复制生命的遗传实际上是染色体DNA自我复制的结果遗传物质自我复制子代基因表达表型DNARNAProtein翻译生理功能运输中心法则DNA由一个拷贝变成两个拷贝复制的准确性解决的问题双链DNA解旋成单链，以每一条单链为模板合成它的互补链，产生两个子代双链DNA分子，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。DNA的半保留复制（semiconservativereplication）双链DNA分子的半保留复制机理Meselson—Stah▼先把大肠杆菌在96.5％同位素纯度的15N培养液中培养15代，在重同位素15N中经过多次细胞分裂使所有细菌DNA都被15N标记。▼然后把这些细胞转移到含正常轻同位素14N的培养液中培养。在不同时间取出样品，每个样品都用SDS裂解细胞。裂解液以CsCl密度离心，达到平衡时，DNA分子就停在等密度区不再移动，紫外光下可以看到一条吸收带。用15N标记的DNA密度大于正常14N的DNA密度，它在离心管较低的部位形成一条区带。亲代DNA分子第一子代分子第二子代分子15N-DNA14N-DNA混合123DNA半保留复制及实验依据AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT母代DNA子代DNA半保留复制半保留复制的意义按半保留复制方式，亲代DNA所含的信息以极高的准确度传递给子代DNA分子,子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。第一部分，DNA合成的化学反应和DNA聚合酶的功能ThereplicationofDNADNA合成的化学反应ThereplicationofDNADNA合成需要：dNTP,引物和模板(primer:templatejunction)合成从引物3’末端开始延伸水解焦磷酸pyrophosphate(PPi)为DNA的合成提供能量SubstraterequiredforDNAsynthesisDNA聚合酶(DNAPol)的机制ThereplicationofDNADNAPol用一个活性位点催化DNA的合成一个位点可以接受四种dNTPs.不同的dNTP是怎样识别的？通过A-T&G-C碱基配对;不匹配的配对会大大降低催化的速度(kineticselectivity).ThemechanismofDNAPol通过活性位置的空间位阻（stericexclusion）区分rNTP和dNTPThemechanismofDNAPolDNAPol像一只手紧握引物和模板的结合处ThemechanismofDNAPolSchematicdrawingT7DNApolThumbFingersPalm催化位点：dNTPs的添加和去除结合了两个二价金属离子，改变活性位点周围的化学环境(how?)DNA聚合酶的手掌结构域(palmdomain)结合进入的dNTP,并将正确配对的dNTP围住，为催化作准备将模板DNA链弯曲，只暴露出一个碱基和进入的dNTP配对DNA聚合酶的手指结构域(fingerdomain)和合成后的DNA相互作用，以维持引物和活性位点的正确位置，并维持聚合酶和它的底物的紧密结合DNA聚合酶的拇指结构域(thumbdomain)DNA聚合酶是持续合成酶(processiveenzymes)ThemechanismofDNAPol持续合成(Processivity)是酶催化多聚底物(polymericsubstrates)的一种特性.TheprocessivityofDNAPolistheaveragenumberofnucleotidesaddedeachtime.DNA的合成速率和聚合酶的持续合成性能密切相关,因为关键的限速步骤在于聚合酶和引物与模板交接处的结合.核酸外切酶活性(Exonucleases)保证DNA合成的正确性ThemechanismofDNAPol碱基偶尔的变构会导致碱基的错误配对.(10-5mistake)错误配对的dNMP能被核酸外切酶切除，这里的核酸外切酶是DNA聚合酶的一部分Howdoestheexonucleaseswork?Kineticselectivity第二部分，介绍在染色体背景下的DNA合成，合成发生在复制叉处(replicationfork)，需要一系列的蛋白参与ThereplicationofDNADNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。ori(或o）、富含A、T的区段。从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子。复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉。1.基本概念复制叉(Thereplicationfork)ThereplicationofDNAThejunctionbetweenthenewlyseparatedtemplatestrandsandtheunreplicatedduplexDNA两条子代DNA链都在复制叉处合成ThereplicationforkReplicationfork几个概念：在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。前导链和滞后链是同时合成的.两条子链的同时合成需要多个聚合酶的参与，DNAPolIIIholoenzymeissuchanexample.新DNA链的合成需要一个RNA引物Thereplicationfork引物酶(Primase)是一个特异的RNA聚合酶，专门负责在单链DNA(ssDNA)模板上合成短的RNA引物，对DNA的序列没有要求DNAPol能够延伸结合在模板上的RNA或DNA引物RNA引物需要被去除才能完成DNA链的合成Thereplicationfork引物的去除由RNaseH完成，完全合成新链还需要DNApolymerase&DNAligase的共同作用Thereplicationfork拓扑异构酶(Topoisomerase)去除在复制叉处解链形成的超螺旋(supercoils)DNA解旋酶(DNAhelicases)在复制叉的前面解除双螺旋ThereplicationforkHexamericprotein单链结合蛋白(Single-strandedbindingproteins,SSBs)稳定DNA的单链状态ThereplicationforkCooperativebindingSequence-independentmanner(electrostaticinteractions)ThereplicationforkDNAhelicase,SSB,primase,DNAtopoisomerase没有其他酶（蛋白）的帮助DNA聚合酶不能完成复制DNA聚合酶的特异性ThereplicationofDNADNAPols在细胞里负责不同的角色ThespecializationofDNApol每个物种都要一套特异的DNA聚合酶不同物种的DNA聚合酶不一样DNAPolIII全酶(holoenzyme):大肠杆菌细胞里负责基因组复制的蛋白复合体DNAPolI:去除RNA引物(E.coli)滑行夹(Slidingclamps)大大提高了DNA聚合酶的活性ThespecializationofDNApol环绕新合成的双链DNA和在引物处的聚合酶。保证DNA聚合酶和模板与引物交接处的快速重结合，增加聚合酶的持续合成能力。EukaryoticslidingDNAclampisPCNASlidingDNAclampsarefoundacrossallorganismandshareasimilarstructure开放的滑行夹通过滑行夹加载器(clamploaders)加到DNA上ThespecializationofDNApolClamploader是一系列特殊的蛋白复合体，催化滑行夹打开，并将其放到DNA上，只要存在引物和模板的结合(primer-templatejunction)，这一过程就会发生.当所有相关的酶完成他们的功能后，滑行夹才离开ThecompositionoftheDNAPolIIIholoenzymeTrombonemodelDNA聚合酶III全酶,解旋酶和引物酶相互作用形成复制体replisome,是一个精确调解的DNA合成工厂，其中的每个蛋白就是一台机器，它们高度协调.复制机器：replicationmachinery转录机器：transcriptionmachinery翻译机器：Translationmachinery第三部分，DNA复制的起始和终止ThereplicationofDNADNA的复制在所有细胞里都受到严密的调控，其调控发生在复制的起始阶段DNA复制的起始ThereplicationofDNA特异的基因组DNA序列指导复制的起始复制起点(Originsofreplication),在复制起点处解开DNA双螺旋，复制从这里开始InitiationofDNAreplication复制起始的复制子模型ProposedbyJacobandBrennerin1963AlltheDNAreplicatedfromaparticularoriginisareplicon(复制子)Twocomponents,replicator(复制基因)andinitiator(起始因子),controltheinitiationofreplicationInitiationofDNAreplicationReplicator:theentiresiteofcis-actingDNAsequencessufficienttodirecttheinitiationofDNAreplicationInitiatorprotein:specificallyrecognizesaDNAelementinthereplicatorandactivatestheinitiationofreplicationoriC♦四个9bp的重复序列dnaA结合位点♦三个13bp的重复序列若干GATC位点oriC复制基因序列包含起始因子结合位点和很容易解开的DNA序列InitiationofDNAreplication真核生物有多个复制起点平均30000－300000bp就有一个复制起点。起始因子蛋白的三个功能:(1)bindstoreplicator,(2)distorts/unwindsaregionofDNA,(3)interactswithandrecruitsadditionalreplicationfactorsDnaAinE.coli(all3functions),originrecognitioncomplex(ORC)ineukaryotes(functions1&3)蛋白质和蛋白质及蛋白和DNA的相互作用指导了起始过程BindingandunwindingDnaArecruits(募集)theDNAhelicaseDnaBandthehelicaseloaderDnaCDnaBinteractswithprimasetoinitiateRNAprimersynthesis.Eukaryoticchromosomearereplicatedexactlyoncepercellcycle,whichiscriticalfortheseorganimsBindingandunwindingPre-replicativecomplex(pre-RC)formationdirectstheini