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真核基因表达调控第七讲绪论一、真核基因组的一般构造特点二、真核基因的转录三、反式作用因子对转录的影响四、真核基因表达调控的主要模式五、其它水平上的基因调控本章主要内容绪论真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。人类细胞单倍体基因组就包含有3×109bp总DNA，约为大肠杆菌总DNA的1000倍，是噬菌体总DNA的10万倍左右！真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。转录水平调控；转录后水平调控；翻译水平调控；蛋白质加工水平的调控等。研究基因调控主要应回答的3个问题：①什么是诱发基因转录的信号？②基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？③不同水平基因调控的分子机制是什么？一、真核基因组的一般构造特点1、真核基因组的复杂性▲真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。▲真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。▲原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。▲细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题。▲原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。▲原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。▲原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列：①高度重复序列，这类序列一般较短，长10－300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的10－60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。②中度重复序列，这类序列多数长100－500bp，重复101－105次，占基因组10-40%。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次。③单拷贝序列，这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。2、真核基因组的一般构造特点①在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。②真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。③高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。④真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。⑤在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5‘上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑RNA聚合酶与它的结合。⑥真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。⑦许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质3、真核基因表达调控的特点(1)真核基因表达调控的环节更多真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排，即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。此外，真核细胞中还会发生基因扩增，即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大量核糖体。又如MTX是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的DNA区段扩增4000倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。(2)真核基因的转录与染色质的结构变化相关1.染色质结构影响基因转录：松散的常染色质中的基因可以转录。紧凑折叠结构的异染色质从未见有基因转录表达，可见紧密的染色质结构阻止基因表达。2.组蛋白的作用：组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用。3.转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加：高敏感点常出现在转录基因的5′侧区、3′末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附近，分析该区域核小体的结构发生变化，可能有利于调控蛋白结合而促进转录。4.DNA拓扑结构变化：天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时，RNA聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移动转录；而负性超螺旋则有利于核小体的再形成。5.DNA碱基修饰变化：真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5－甲基胞嘧啶，这种甲基化最常发生在某些基因5′侧区的CpG序列中，这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡，可见DNA的甲基化对基因表达调控是重要的。(3)真核基因表达以正性调控为主真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍；真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白的作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之：真核基因表达以正性调控为主导。4、真核生物基因家族①简单多基因家族●rRNA基因家族原核生物中16S、23S、5S的rRNA基因联合为一个转录单位，细菌所有rRNA和部分tRNA都来自30S的前体rRNA真核生物中18S、28S、5.8S的rRNA包括在45S的前体rRNA分子中，经甲基化后被特异的RNA切割酶切割而成。②复杂多基因家族复杂多基因家族由几个基因家族构成，其间由间隔序列隔开。●组蛋白基因家族5个基因组成串联单位且重复1000多次串联单位中每个基因分别转录成单顺反子RNA，这些的RNA都无内含子，在一条DNA一按同一方向转录。③发育控制的复杂多基因家族珠蛋白基因家族人类发育阶段中血红蛋白组成的变化：所有动物血红蛋白基因的基本结构相同，但在个体发育不同时期却出现不同形式的亚基。发育阶段血红蛋白组成胚胎期（8周前）ξ2ε2ξ2γ2α2ε2胎儿期α2γ2成年期α2δ2α2β25、真核基因的断裂结构（外显子与内含子）外显子：编码序列（10%左右？）内含子：非编码序列只有真核生物具有切除基因中内含子，产生功能型mRNA和蛋白质的能力。外显子与内含子连接区：外显子与内含子的交界或边界序列，特征：内含子两端序列不能互补，其上游和下游序列不能形成发卡结构，连接区序列很短，但却高度保守，可能是RNA剪切的信号序列。外显子与内含子的可变调控：组成性剪接：基因转录产物精确剪接成一种mRNA选择性剪接：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同的mRNA6、真核生物DNA水平上的基因表达调控1、开放型活性染色质结构对转录的影响转录前染色质在特定区域发生核小体结构的消除或改变、DNA本身局部结构变化、DNA从右旋到左旋转变等，促使结构基因暴露而诱发基因转录.处于活跃状态的基因的在染色质上有一个或数个DNA酶I敏感位点（多位于5‘端启动区）比非活跃态基因易被DNA酶I所降解。DNA酶I敏感位点的产生是染色质结构规律变化的结果，该变化使DNA易与RNA聚合酶和其它转录调控因子结合，从而启动基因表达，也易被DNA酶I所降解。2、基因扩增卵母细细胞形成发育过程中，基因（如rDNA）大量扩增以满足大量蛋白质的需要。例：非洲爪蟾及果蝇卵母细细胞发育3、基因重排与变换将一个基因从远离启动子处移到距它很近的位点从而启动转录。例：免疫球蛋白结构基因和T－细胞受体基因的表达在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(λ和κ链)基因座都由多个编码V区(可变区）和C区（恒定区）蛋白质的基因组成，并被非编码的DNA（连接区，J区）所分隔。V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞发育分化时，免疫球蛋白重链基因DNA重排，大量间隔序列被切除，使位于J-Cμ之间的增强子序列得以发挥作用，增强基因转录。酵母细胞的“交配型转换”（基因转换）（P249图）7、DNA甲基化与基因表达DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化的主要形式5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中。原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型甲基转移酶，另一种是从头合成型甲基转移酶。前者主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。后者催化未甲基化的CpG成为mCpG，速度很慢。日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而I类和III类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，所以，高等真核生物中CG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组中约存在4万个CG序列，大多位于转录单元的5'区。没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，就可能被氧化成为U，被DNA修复系统所识别和切除，恢复成C。已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用,它就变为T,无法被区分。因此,CpG序列极易丢失。返回首页DNA甲基化抑制基因转录的机理：DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性，从而影响到DNA与蛋白质相互作用方式的改变，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。主要是不利于模板DNA与RNA聚合酶的结合。如：引起B－DNA向Z－D