现代分子生物学-第三章

第三讲生物信息的传递（上）从DNA到RNA1、RNA的转录2、转录机器的主要成分3、启动子与转录起始4、终止和抗终止5、原核生物和真核生物mRNA特征比较6、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰FromDNAtoProteinDNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同(除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。3.1RNA的转录(Transcription)生物体内拥有三类RNA：1、编码特定蛋白质序列的mRNA；2、能特异性解读mRNA中的遗传信息并将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的tRNA；3、直接参与核糖体中蛋白质合成的rRNA。DNA-mRNA-theencodedpeptide编码链（codingstrand）:与mRNA序列相同的那条DNA链,或称有意义链（sensestrand）.模板链（templatestrand）:根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链,或称反义链（antisensestrand）。DNA模板与分子及多肽链之间存在共线性关系Transcription:thesynthesisofasingle-strandedRNAfromadouble-strandedDNAtemplate.1.RNA是以5’3’方向合成的，它的序列是与DNA编码链（意义链）相同。2.RNA的合成是以反义链（模板链）为模板。3.同在DNA中一样，形成磷酸二脂键（Phosphodiesterbonds）。4.必需的成分:RNApolymerase,rNTPs,transcriptionfactors,promoter&terminator/templateRNA合成的特点转录的基本过程1、模板识别(TemplateRecognition)2、转录起始(Initiation)3、转录的延伸(Elongation)4、转录的终止(Termination)1、RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。模板识别2、转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。1.在起始位点合成RNA链：第一个核苷酸键的产生，该位点被称为position+1。转录起始2.转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段。3.通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。转录的延伸RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。•共价地向生长RNA链的3’端添加核糖核苷酸•RNA聚合酶是以5’3’方向来延长RNA链•RNA聚合酶本身沿着反义链以3’5’方向移动转录的终止•合成的终止：当RNA链延伸到转录终止位点时，RNApolymerase和RNA链均从DNA模板上释放出来。•Terminator:通常含有自我互补区域(self-complementaryregions)，在RNA产物中可以形成stem-loop或hairpin结构。真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物(PIC)以保证有效地起始转录。前起始复合物(preinitiationtranscriptioncomplex,PIC)3.2转录机器的主要成分1.RNA聚合酶(RNApolymerase)2.转录复合物RNA聚合酶(RNApolymerase)RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶。1.主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体。2.需要Mg2+/Mn2+为辅助因子。3.它不需要任何引物。4.以5’3’方向合成RNA链。5.缺乏3’5’外切酶活性。6.是一个含有多个亚单位(multi-subunit)的酶。(1)识别DNA双链上的起始子；(2)使DNA变性在启动子处解旋成单链；(3)通过阅读启动子序列，RNAPol确定它自己的转录方向和模板链。(4)最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。RNA聚合酶需执行的功能2alpha(α)subunit,1beta(β)subunit,1betaprime(β’)subunit,1omega(ω)subunit,1sigma(σ)subunit原核生物(E.coli)的RNA聚合酶CoreenzymeHoloenzyme聚合酶全酶相对分子量：4.65×105参与转录延伸只与转录的起始有关36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD•E.coli只有一个DNA-directedRNA聚合酶，来合成所有类型的RNA。原核生物(E.coli)的RNA聚合酶•是细胞中最大的酶之一。•由5种subunits组成聚合酶全酶(holoenzyme),包括2α,1β,1β’,1ω以及1σsubunits。•形状象一个圆筒状通道，可以直接与16bpDNA结合。整个聚合酶可结合60bpDNA。•RNA合成速率:40nt/秒,37oC。表3-1大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA3.65×1042核心酶核心酶组装，启动子识别。βrpoB1.51×1051核心酶β和β’共同形成RNA合成的活性中心。β’rpoC1.55×1051核心酶ω？11×1041核心酶未知σrpoD7.0×1041σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子•是核心酶中的两个相同的亚单位•由rpoA基因编码•与核心酶的组装有关•参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用E.coliRNApolymerase:αsubunit*T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰，造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力降低。•β和β’分别由rpoB和rpoC基因编码。E.coliRNApolymerase:β&β’subunit•由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心。•它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。•β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。rpoB和rpoC基因的突变会影响转录所有的阶段。负责模板链的选择和转录的起始：E.coliRNApolymerase:σfactor•与σ因子的结合使RNA聚合酶从核心酶转变为聚合酶全酶。•是启动子识别的关键的酶，不仅增加聚合酶对启动子的亲和力(提高103倍)，还可降低它对非专一位点的亲和力(降低104倍)，使酶底复合物的半衰期小于1s。•在细胞中对σ因子量的需求少于聚合酶中其它亚单位。大肠杆菌中的σ因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合因子基因功能-35区间隔（bp）-10区σ70rpoD广泛TTGACA16-18TATAATσ32rpoH热休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTAσ54rpoN氮代谢CTGGNA6TTGCA•有3类RNA聚合酶；真核生物的RNA聚合酶•结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂；•在细胞核中的位置不同；•负责转录的基因不同，对α-鹅膏蕈碱的敏感性也不同。•真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较酶细胞内定位转录产物相对活性对α-鹅膏蕈碱的敏感程度RNA聚合酶I核仁rRNA(28S,18S,5.8S)50%-70%不敏感RNA聚合酶II核质hnRNA*,snRNA,mRNA20%-40%敏感RNA聚合酶III核质tRNA,5SRNA,snRNA约10%存在物种特异性*hnRNA:heterogeneousnuclearRNA,核内不均一RNA,RNA的前体转录的抑制剂抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌全酶和β亚基结合，抑制起始链霉溶菌素细菌核心酶和β亚基结合，抑制起始放射线素D真核PolⅠ和DNA结合，阻止延伸α-鹅膏蕈真核PolⅡ和RNAPolⅡ结合RNA合成抑制剂主要分两类:1.模板结合抑制剂2.聚合酶抑制剂•在动、植物及昆虫的细胞中，RNAPolⅡ的活性可被低浓度的α-鹅膏蕈碱所抑制。但却不抑制polⅠ。•PolⅢ对α-鹅膏蕈的反应，不同的生物有所差异。在动物细胞中高浓度的α-鹅膏蕈可抑制转录，在昆虫中不受抑制。真核生物RNA聚合酶的亚基RNA聚合酶IRNA聚合酶IIRNA聚合酶IIIRPA1RPB1(’)RPC1RPA2RPB2()RPC2RPC5RPB3(αI)RPC5RPC9RPB11(αII)RPC9RPB6RPB6(ω)RPB6其它9个亚基其它7个亚基其它11个亚基注：亚基按照分子量由大到小的顺序排列。真核生物RNA聚合酶一般有8-16个亚基所组成,相对分子质量超过5×105。•聚合酶中有两个相对分子质量超过1×105的大亚基；真核生物RNA聚合酶的主要特征•同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的。真核生物线粒体和叶绿体中存在不同的RNA聚合酶线粒体中RNA聚合酶：•只有一条多肽链，相对分子量小于7X104，是已知最小的RNA聚合酶之一；•与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。叶绿体中RNA聚合酶：•比较大；•结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因编码。线粒体和叶绿体RNA聚合酶活性不受α-鹅膏蕈碱所抑制。模板DNA进入转录复合体的路径（A）俯瞰图。双螺旋DNA用倾斜的圆筒表示，TFII转录因子的结合位点用虚圈表示；（B）后视图。DNA从钳子型结构和墙体或平滑结构的中间穿越。TherearevariouschannelsallowingDNA,RNAandribonucleotides(rNTPs)intoandoutoftheenzyme’sactivecentercleftRNApolymerase/transcriptionandDNApolymerase/replicationRNApolDNApolTemplatedsDNAdsDNARequireprimerNoYesInitiationpromoteroriginelongation40nt/sec900bp/secExonucleaseactivityNoYesterminatorSynthesizedRNATemplateDNA封闭复合物（closedcomplex）:启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物，此时，DNA仍处于双链状态。开放复合物（opencomplex）:聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开,封闭复合物转变成开放复合物。对于强启动子来说，从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的，是快反应。转录复合物开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后即转变成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元复合物(ternarycomplex)。RNA合成的起始1.核心酶在σ因子参与下与模板DNA接触，生成非专一、不稳定的复合物在模板上移动；2.起始识别：全酶与模板的启动子结合，产生封闭的“酶-启动子二元复合物”（closedbinarycomplex）；3.全酶紧密地结合在启动子的-10序列处，模板DNA局部变性，形成“开放的启动子二元复合体”（openbinarycomplex）；4.酶移动到转录起始点挂上，第一个rNTP转录开始，σ因子释放，形成酶-启动子-rNTP三元复合体。DNA的转录循环假说transcriptioncycle——translocationmechanism三磷酸核苷酸（NTP）填补了开放的底物位点并在活性位点形成磷脂键；此时，处于RNA聚合酶II活性位点的核酸发