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现代微生物学与实验技术参考资料：沈萍主编微生物学金志华等编著工业微生物遗传育种学原理与应用罗大珍等主编现代微生物发酵及技术教程杜连祥等主编微生物学实验技术诸葛健编著工业微生物资源开发应用与保护姚汝华主编微生物工程工艺原理微生物学报、生物工程进展、生物技术、微生物通报等期刊第一章绪论一微生物学的发展1.微生物科学1.1研究对象及分类地位微生物学：研究微生物在一定条件下的形态结构、生理生化、遗传变异以及微生物的进化、分类、生态等生命活动规律及其应用的一门学科。分类1753年二界系统（植物界、动物界）瑞典博物学家林奈《植物种志》1866年三界系统（植物界、动物界、原生生物界）海格尔1938年（1956更成熟）四界系统（植物界、动物界、原始生物界、菌界）柯普兰1969年五界系统（植物界、动物界、原生生物界、真菌界、原核生物界）魏塔克根据生物获得营养的方式不同，把真菌提升为界1977年六界系统（动物、植物、原生生物、真菌、原核生物、病毒）王大耜等70年代三域学说（分子尺：16SrRNA）古生菌域（产甲烷菌、极端嗜盐菌、嗜热嗜酸菌等）真细菌域（蓝细菌、除古生菌外细菌）真核生物域（动物、植物、真菌、原生生物）20世纪70年代以前，生物类群间的亲缘关系主要是根据形态结构、生理生化、行为习性等表型特征以及少量的化石资料来判断它们之间的亲缘关系。要使分类系统真正成为总结生物进化历史的生物系谱，需要系统的古生物资料来阐明各类生物之间的共祖、分支和年代关系。因此，在缺乏化石资料的情况下，最为艰难的任务是如何确定类群之间的进化关系，用什么特征作为划分类群的主要特征。根据形态学特征推断生物之间的亲缘关系存在两个突出问题：一是由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有生物放在同一水平上进行比较；二是形态特征在不同类群中进化速度差异很大，仅根据形态推断进化关系往往不准确。因此，70年代以后研究微生物的系统发育，主要是分析和比较生物大分子的结构特征，特别是蛋白质、RNA和DNA这些反映生物基因组特征的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有生物进化关系的主要指征。大量研究表明：蛋白质、RNA和DNA序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定。因此，这些生物大分子被看作是分子计时器或进化钟，它们真实地记录了各种生物的进化过程。我们可以通过比较不同类群的生物大分子序列的改变量来确定它们彼此系统发育相关性或进化距离。在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，表示它们进化距离远，这两群生物在进化过程中很早就分支了；如果两群生物同一来源的大分子的序列相同，说明它们处在同一进化水平上。挑选恰当的大分子应注意以下几点：(1)它必须普遍存在于所研究的各个生物类群中。(2)选择在各种生物中功能同源的大分子。(3)为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进一步的分析比较。(4)还应注意根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当的分子序列。当我们比较亲缘关系远的生物类群时，必须选择变化速率低的分子序列,因为序列变化速率高的分子，在其进化过程中共同的序列已经丧失。16SrRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”，这是因为：(1)rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变；(2)在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；(3)16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析。5SrRNA信息量小，应用上受很大限制；23SrRNA分子量大，序列测定和分析比较工作量大，使用时难度较大；(4)16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)，因此它可以作为测量各类生物进化的工具——这一点极为重要。1981年美国学者伍斯等根据某些代表生物16SrRNA(或18SrRNA)序列比较，首次提出了一个函盖整个生命界的系统树，而后又进行了多次修改和补充。图为近年提出的一个全生命系统树：伍斯提出将生物分成为三界(Kingdom)(后来后改称三个域Domain)：古细菌(archaebacteria)、真细菌(Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。伍斯三界理论提出后，国际上对生物的系统发育进行了更广泛的研究，除了继续对rRNA序列进行比较外，还广泛研究了其他特征，包括许多表型特征。研究结果表明：三界理论虽然是根据16SrRNA序列的比较提出的，但其他特征的比较研究结果也在一定程度上支持了三界生物的划分。据报导，古生菌--詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的全基因组序列测定结果及其通过计算机软件与少数真细菌和真核生物全基因组序列所进行的初步比较，其结果虽未显示出古生菌与真核生物较真细菌亲缘关系更近的结论，但也初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。古生菌作为当今仍生活在地球上某些极端环境(高盐、低PH、高温、高压或极端缺氧环境)的一个特殊群体(上述产甲烷球菌就是生活在2600m深、200大气压、94℃左右的海底火山口附近)，其特殊的生境与地球生命起源初期的环境有许多相似之处。三界学说的建立和发展，其主要意义并不在于目前研究所取得的某些结论，更重要的是它为进一步探讨生命起源和进化，进一步认识、研究和开发微生物资源提出了新的思路，它所提出的研究生物进化的技术方法使我们看到了揭开生命起源和进化之谜的曙光。当然，随着研究的进一步深入，其学说也必然面临新的挑战建立16SrRNA系统发育树的意义1）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；2）提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法；3）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；4）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全新的微生物分类、鉴定理论；5）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究。1.2微生物学的分支学科研究对象、种类：细菌学、真菌学、病毒学、原核生物学、自养菌生物学等分科、内容：微生物生理学、遗传学、生态学、分子微生物学等生态环境：土壤微生物学、海洋微生物学、微生态学、环境微生物学等实验方法：实验微生物学、微生物研究方法学科交叉、融合：化学微生物学、分析微生物学、微生物生物工程学、微生物化学分类学、微生物数值分类学、微生物地球化学、微生物信息学等应用：工业微生物学、农业微生物学、医学微生物学、环境微生物学、食品微生物学、分子微生物学等2.微生物学的发展史2.1史前期（8000年前－1676年）感性认识阶段•自古以来，人类在日常生活和生产实践中，已经觉察到微生物的生命活动及其所发生的作用。中国利用微生物进行酿酒的历史，可以追溯到4000多年前的龙山文化时期。殷商时代的甲骨文中刻有“酒”字。北魏贾思勰的《齐民要术》（533～544）中，列有谷物制曲、酿酒、制酱、造醋和腌菜等方法。•在古希腊留下来的石刻上，记有酿酒的操作过程。中国在春秋战国时期，就已经利用微生物分解有机物质的作用，进行沤粪积肥。公元1世纪的《氾胜之书》提出要以熟粪肥田以及瓜与小豆间作的制度。2世纪的《神医本草经》中，有白僵蚕治病的记载。6世纪的《左传》中，有用麦曲治腹泻病的记载。在10世纪的《医宗金鉴》中，有关于种痘方法的记载。1796年，英国人E．琴纳发明了牛痘苗，为免疫学的发展奠定了基础2.2初创期（1676－1861年）形态学发展阶段•17世纪，荷兰人列文虎克用自制的简单显微镜（可放大160～260倍）观察牙垢、雨水、井水和植物浸液后，发现其中有许多运动着的“微小动物”，并用文字和图画科学地记载了人类最早看见的“微小动物”——细菌的不同形态（球状、杆状和螺旋状等）。过了不久，意大利植物学家P．A米凯利也用简单的显微镜观察了真菌的形态。•1838年，德国动物学家C．G．埃伦贝格在《纤毛虫是真正的有机体》一书中，把纤毛虫纲分为22科，其中包括3个细菌的科（他将细菌看作动物），并且创用bacteria（细菌）一词。1854年，德国植物学家F．J．科思发现杆状细菌的芽孢，他将细菌归属于植物界，确定了此后百年间细菌的分类地位。2.3奠基期（1861－1897年）生理学发展阶段•微生物学的研究从19世纪60年代开始进入生理学阶段。法国科学家L．巴斯德对微生物生理学的研究为现代微生物学奠定了基础。他论证酒和醋的酿造以及一些物质的腐败都是由一定种类的微生物引起的发酵过程，并不是发酵或腐败产生微生物；他认为发酵是微生物在没有空气的环境中的呼吸作用，而酒的变质则是有害微生物生长的结果；他进一步证明不同微生物种类各有独特的代谢机能，各自需要不同的生活条件并引起不同的作用；他提出了防止酒变质的加热灭菌法，后来被人称为巴斯德灭菌法，使用这一方法可使新生产的葡萄酒和啤酒长期保存。•科赫对新兴的医学微生物学作出了巨大贡献。•科赫首先论证炭疽杆菌是炭疽病的病原菌，接着又发现结核病和霍乱的病原细菌，并提倡采用消毒和杀菌方法防止这些疾病的传播；•他的学生们也陆续发现白喉、肺炎、破伤风、鼠疫等的病原细菌，导致了当时和以后数十年间人们对细菌给予高度的重视；•他首创细菌的染色方法，采用了以琼脂作凝固培养基培养细菌和分离单菌落而获得纯培养的操作过程；•他规定了鉴定病原细菌的方法和步骤，提出著名的科赫法则。代表人物：A巴斯德（1822－1895年）法国人—微生物学奠基人，“微生物学之父”贡献生物学基础理论：彻底否定“自然发生说”，提出生源说引进“好氧”和“厌氧”两个术语工业：①证实发酵是由微生物引起的②提出巴氏消毒法（60℃，30min）农业：①家蚕软化病的防治②建立了免疫学预防接种（鸡霍乱疫苗；牛羊炭疽菌疫苗）法国人巴斯德（LouisPasteur）（1822～1895）巴斯德逝世百年纪念邮票代表人物：B柯赫（1843－1910年）德国人—细菌学的奠基人贡献①建立了研究微生物的一系列重要方法，如，发明了固体培养基、微生物的纯种分离、显微染色技术、显微摄影技术等；②利用平板分离方法寻找并分离到许多病原菌，如炭疽病菌（1877）、结核杆菌（1882）、链球菌（1882）、霍乱弧菌（1883）等；③提出了柯赫法则(1884)。1905年，德国人科赫获得了诺贝尔医学和生理学奖，主要是为了表彰他在肺结核研究方面的贡献。科赫法则（Koch’spostulates）1、在每一相同病例中都出现这种微生物；2、要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；4、从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物。1860年，英国外科医生J．利斯特应用药物杀菌，并创立了无菌的外科手术操作方法。俄国出生的法国微生物学家C．H．维诺格拉茨基于1887年发现硫细菌，1890年发现硝化细菌、铁细菌等化能自养菌，他论证了土壤中硫化作用和硝化作用的微生物学过程以及这些细菌的化能营养特性。他第一次从土壤中分离出厌氧的自生固氮菌—巴氏德梭菌等，并运用无机培养基、选择性培养基以及富集培养等原理和方法，研究土壤细菌各个生理类群的生命活动，揭示土壤微生物参与土壤物质转化的各种作用，开辟了研究微生物生态和微生物在自然界物质循环中作用等重要课题，奠定了土壤微生物学的基础。•贝杰林克（Beijerinck)，荷兰微生物学家，1888年，成功地从豆科根瘤中分离出根瘤菌，揭示了共生固氮现象等；1891年，又最早分离和发现了好氧的固氮细菌；是土壤微生物学的奠基人之一，对普通微生物学的发展也做出了突出贡献。•1892年，俄国植物生理学家Д．И．伊