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实验十一专题一植物的组织培养一．学习目标1.说明植物组织培养的基本原理。2.学习植物组织培养的基本技术。3.进行菊花或其他植物的组织培养。二．知识整合（一）、细胞的全能性含义生物体的细胞具有使后代细胞形成完整的个体的潜能。基础每个体细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体的全部基因。程度由高到低依次是受精卵＞生殖细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞；体细胞中：幼嫩组织细胞（分化程度低的细胞）＞成熟的组织细胞（分化程度高的细胞）表现条件①离体②营养物质③激素④适宜外界条件与植物组织培养的关系（1）植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础（2）离体的植物组织或细胞经过脱分化和再分化能表达其全能性（二）、植物组织培养过程比较过程名称过程形成体特点条件脱分化（去分化）由离体的器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程称为脱分化排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞①离体②提供营养物质③激素④提供适宜外界条件再分化脱分化产生的愈伤组织继续培养，又可以重新分化为根或芽等器官，这个过程称为再分化。有芽、根或有生根发芽能力营养生长生殖生长幼苗发育成完整的植物体的过程由根、茎、叶、花、果实、种子组成栽培条件（三）、MS固体培养基与微生物培养基项目MS固体培养基牛肉膏蛋白胨培养基碳源蔗糖（维持细胞渗透压）牛肉膏氮源无机盐、大量元素蛋白胨无机盐大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、CoNaCl、牛肉膏、蛋白胨提供磷酸盐特殊营养物质甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素（满足离体植物细胞在正常代谢途径受一定影响后所产生的特殊营养物质需求）牛肉膏、蛋白胨提供维生素激素多种植物激素不需要（四）、植物激素在组织培养过程中的重要作用植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。植物激素的浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，都会影响实验结果。①按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果。使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先使用细胞分裂素，后使用生长素细胞既分裂又分化同时使用分化率提高②当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。生长素用量比细胞分裂素用量植物细胞的发育方向比值高时有利于根的分化、抑制芽的形成比值低时有利于芽的分化、抑制根的形成比值适中时促进愈伤组织的生长（五）、被子植物花粉发育过程1.发育场所：被子植物雄蕊的花药中。2.分裂方式：花粉是由花粉母细胞经减数分裂和有丝分裂而形成的，因而花粉是单倍体的生殖细胞。其中有小孢子母细胞到小孢子过程是减数分裂，其余均为有丝分裂。3.发育过程：（1）图像（2）图解小孢子母细胞→四分体时期→单核期→双核期（营养细胞+生殖细胞含两个精子）4.区分四分体与四分体时期减数分裂过程中四分体：在减数第一次分裂时同源染色体联会，每条染色体汗两条姐妹染色单体，因此联会后的每对同源染色体含四条染色单体，叫四分体。花粉发育过程中的四分体时期：小孢子母细胞经减数分裂形成4个单倍体细胞，4个单倍体细胞连在一起，称为四分体时期。六、菊花组织培养与月季花药培养的比较比较项目菊花组织培养月季花药培养相同点原理植物细胞的全能性环节培养基配制方法、无菌技术及接种操作基本相同条件受温度、酸碱度和光照等外界条件的影响不同点选材未开花植株茎上部新萌生的侧枝完全未开放的花蕾外植体类型体细胞生殖细胞培养过程影响因素内因不同的植物组织，培养的难易程度差别很大，容易进行无性繁殖的植物也容易进行组织培养。同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短也有影响。幼龄、保存时间短的植物材料容易培养成功。（1）不同植物的诱导成功率很不相同。（2）就同一植物来说，亲本植株的生理状况对诱导成功率也有直接影响。（3）花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。确定花粉发育时期的最常用方法有醋酸洋红法和焙花青――铬矾法，焙花青――铬矾法能将花粉细胞核染成蓝黑色。（4）亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响。外因1.培养基的组成2.植物激素的浓度、使用先后顺序以及用量比例都会影响试验结果。由于菊花茎段的组织培养比较容易，因此，不必添加植物激素。3.外界条件：pH=5.8、温度为18-22℃，并且每日用12h光照1.花药培养对培养基配方的要求更为严格。花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基。2.需要严格控制使用激素的量3.培养条件：pH=5.8、培养温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。培养结果正常植株单倍体植株生殖类型无性生殖有性生殖（单性生殖）实验流程制备培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培选材→消毒→接种→培养→鉴定和筛选→移栽专题二蛋白质的提取和分离一．学习目标1.尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。3.了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理。二．知识整合实验方法凝胶色谱法和电泳法实验原理1.凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程短，移动速度快；相对分子质量小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程长，移动速度慢。因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。因此得以分离。2.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的的。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。1.样品处理（1）红细胞的洗涤。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色液体，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。（2）血红蛋白的释放。红细胞在蒸馏水和40%的甲苯作用下破裂，释放血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液。将混合液进行离心后会分层，第3层的红色透明液体是血红蛋白。2.粗分离——透析目的是除去样品中的分子量较小的杂质。3.纯化——凝胶色谱操作实验步骤（1）凝胶色谱柱的制作（2）凝胶色谱柱的装填①装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。②凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现有，必须重装。③装填完后，立即用300ml20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。（3）样品的加入和洗脱①按正确方法加样，不能破坏凝胶面。②进行洗脱时，等红色的蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。4.纯度鉴定——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(选做SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。操作关键1.洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。2.商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要放在洗脱液中膨胀，为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温接近至沸腾，通常需1～2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内空气。3.凝胶色谱柱的装填是分离关键之一，装填时要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装填后不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦出现上述现象都需重填。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。4.分离蛋白质时，要求各种蛋白质同时从相同起点开始分离，在凝胶色谱操作中加样时要保证分离样品进入凝胶层后再接通洗脱液，开始洗脱。在电泳操作中，通过浓缩胶的作用，将样品浓缩后再进入分离胶分离。5.滴加样品时，吸管关口贴管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。专题三PCR技术的基本操作和应用项目PCR操作用具微量离心管、微量移液器、DNA扩增仪（热循环仪）、台式高速离心机、一次性枪头、紫外分光光度计步骤（1）准备：按照PCR反应体系配方将所需试剂摆放到实验桌上（2）移液：用微量移液器按照配方在微量离心管加入各组分（3）混合：盖严离心管盖子，防止脱落或液体外溅，并用手指轻弹管壁，使反应液混合均匀。（4）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s，目的使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。（5）反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。（6）测定：用紫外光光度计测定DNA在260nm紫外线的光吸收值，计算DNA的含量。过程其原理与细胞内DNA复制相似,但反应体系较简单，其基本过程为：①变性：通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。②退火（复性）：将温度降至引物的50℃左右或以下，引物与DNA模扳互补区域结合，形成杂交链。③延伸：当反应体系温度升至72℃左右时，DNA聚合酶催化以引物为起始点的5ˊ→3ˊDNA链延伸反应，形成新生DNA链。以上三步为一个循环，每一个循环的产物作为下一个循环的模板,如此循环30次，介于两个引物之间的DNA片段呈指数扩增。结果(1)DNA扩增的理论数值①开始有1条模板，则复制n次有2n条②开始有m条模板，则复制n次有m×2n条（2）计算DNA含量。公式：DNA含量(g)=50×（260nm的读数）×稀释倍数。成功关键（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸气灭菌。（2）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心臂放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。有关问题1.DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。2.当PCR体系的温度有变性后快速冷却到50℃左右时，引物与模板可结合，一般不需考虑解开的两个DNA链的重新结合，原因是：（1）模板DNA比引物长得多，而且复杂得多，不易重新结合。（2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间碰撞。（3）加入的引物的量足够大而模板链数量少。近年全国高考题1.培育草莓脱毒苗所采用的主要技术是A.组织培养B.细胞杂交C.显微注射D.核移植2.下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是（）A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压B．培养中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同3.某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。下列有关叙述，错误的是A．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害B．在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞C．出芽是细胞再分