32原核生物的转录调控toupload2016年春

原核生物的转录调控转录的两个基本问题：1、蛋白质如何识别DNA的结合位点？2、转录的抑制或增强是如何进行的？基因表达与转录调控重要的概念1、反式作用因子和顺式作用元件2、结构基因和调控基因3、正调控和负调控4、单顺反子和多顺反子5、异构调控反式作用因子和顺式作用元件基因的转录活性主要通过反式作用因子（trans-actingfactor）和顺式作用元件（cis-actingelement）之间的特异相互作用来调节。反式作用因子为蛋白质。例如：RNA聚合酶顺式作用元件为DNA。例如：启动子和终止子反式作用和顺式作用的概念反式作用顺式作用结构基因和调控基因结构基因（structuralgene）：编码RNA或蛋白质（包括结构蛋白、酶和调控蛋白）的基因；调控基因（regulatorgene）:编码调控蛋白（regulatorprotein）的基因，参与调控一个或多个结构基因表达。调控蛋白通过结合在DNA的特定位点以调控其转录。靶基因位点调控蛋白激活蛋白（activator）：增强转录阻遏蛋白（repressor）：抑制转录操纵基因，调控蛋白的结合位点9调控蛋白缺失:基底转录负调控（negativeregulation）：阻遏蛋白结合DNA抑制基因表达正调控（positiveregulation）：激活蛋白结合DNA增强基因表达正调控和负调控单顺反子（monocistonicmessage）和多顺反子（polycistonicmessage）异构调控（allosteryregulation)许多调控蛋白都是变构蛋白(allostericprotein)，通过与效应物结合改变构象而改变活性，起到调节基因转录表达的作用，即异构调控细菌基因表达调控策略：将功能相关的基因集合成组，这样易于整体调控。&相互临近、协同调控的一组基因的被称为操纵子（operon）。如：lac操纵子&非临近但协同调控的一组基因的被称为调节子如：mal调节子操纵子与乳糖操纵子1.提出：1961年,Jacob（雅格布）-Monod（莫诺）.2.操纵子(operon)：操纵子是原核生物基因表达和调控的单元，典型的操纵子包括：结构基因、调控元件和调节基因。大肠杆菌K12中共有4136个基因，以操纵子结构存在的基因接近1/4（256操纵子，控制879基因）操纵子结构结构基因：控制某一代谢途径关键酶的多顺反子。调控元件：启动子和操纵区（覆盖在启动子和编码区交叉区，是阻遏调节蛋白质的结合位点）。调节基因：独立编码蛋白质的基因。调节基因的产物结合调控元件，抑制或激活结构基因的表达。乳糖操纵子ThelacZ,lacY,lacAgenesaretranscribedintoasinglelacZYAmRNA(多顺反子)underthecontrolofasinglepromoterPlac.操纵基因，又称操作子(operator)，为顺式调控元件，不编码任何产物！细菌生长特点环境变化营养供给能量消耗最低化当某种物质不存在时，细菌就不合成该物质代谢途径中的酶；而当该物质出现时，立即合成所需的代谢酶。这种当特定底物出现才合成特定酶的过程称为诱导（induction）。细菌能够快速做出应答，迅速从利用一种物质转变为另一种物质双峰生长(diauxicgrowth)E.coli生长在含有葡萄糖（glucose）和乳糖（lactose）的培养基上。细胞首先利用葡萄糖快速生长，直至葡萄糖耗尽。随后，细胞停止生长，“调整”以适应新的营养源——乳糖。延滞期：约1小时开启lac操纵子，积累乳糖代谢所需要的酶在正常情况下，E.coli是以葡萄糖作为碳源的，葡萄糖是单糖，E.coli利用它最为方便和经济。在没有葡萄糖，只有乳糖存在的条件下，E.coli也能以乳糖为碳源而生存。乳糖是双糖，是葡萄糖和半乳糖的复合物。以乳糖为碳源必须先将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，再将半乳糖转化为葡萄糖，这就需要额外的酶。结果解读细菌开始乳糖代谢所需要的酶1、将乳糖转运至细胞内β-半乳糖通透酶2、乳糖代谢：分解乳糖（二糖）分解为单糖b-半乳糖苷酶3、β-半乳糖苷乙酰转移酶，作用不明。在有葡萄糖存在时，细菌体内的这三种酶含量很低。每个细胞中只有3－5个分子的β—半乳糖昔酶。当培养基中没有葡萄糖而有乳糖存在时，这三种酶的量急剧增加，2－3分钟内即可增加1000倍以上，而且三种酶成比例增加。一旦乳糖用完，在2－3分钟内这三种酶的量又很快下降到本底水平。启动子PlaclacZlacAlaclOlaclacY调控元件结构基因β-半乳糖通透酶β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷乙酰转移酶调节基因操纵基因转录方向转录单元lacZYAPlacI启动子lacZ乳糖/半乳糖苷半乳糖葡萄糖b-半乳糖苷键b-半乳糖苷酶异乳糖b-半乳糖苷酶催化侧链反应使乳糖重排，形成异乳糖（诱导物）lacYlacA突变基因表型LacZ突变体不能进行乳糖代谢LacY突变体不能从培养基中摄取乳糖LacA无影响启动子PlaclacZlacAlaclOlaclacY调控元件结构基因β-半乳糖通透酶分解乳糖半乳糖和葡萄糖运送乳糖透过细胞壁乙酰辅酶A乙酰半乳糖β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷乙酰转移酶乳糖转化异乳糖调节基因操纵基因转录方向转录单元lacZYAPlacI启动子阻遏蛋白lacI（Lacrepressor）1、LacI可以结合DNA，其结合位点为operator（O）;作用机制：LacI结合O位点，从而抑制RNA聚合酶和LacZYA基因启动子（PLac）的结合，从而阻止LacZYAmRNA的生成；2、LacI可以结合诱导物半乳糖，构象发生改变，不能结合operator,从而对Lac操纵子的抑制消失。阻遏蛋白lacI单体具有DNA结合域（Helix-turn-helix，1-59位氨基酸）和诱导物结合域。阻遏蛋白lacI单体寡聚化N’末端C’末端诱导物结合位点阻遏蛋白lacI四聚体的组装诱导物结合部位阻遏蛋白lacI由四个相同的单体亚基组成。O1RNApolymerase:a2bb’s70TTGACATATAAT-35box-10boxs70的一般识别位点TTTACATATGTT-35box-10boxLac操纵子promoter:AAAdownupLac操纵子的O1回文结构InJacobandMonad’smodel,thelacoperoncontainedasingleoperator(O1).􀂾However,twoadditionaloperators(O2andO3)weresubsequentlydiscovered.Infact,therearethreeoperators,theclassicaloperatorO1（majoroperator,主操纵基因）,centeredatposition+11,thedownstreamauxiliaryoperator（辅助操纵基因）O2,centeredatposition+412,andupstreamauxiliaryoperatorO3,centeredat–82.CAPisapositiveregulatorofthelacoperon.四聚体LacI蛋白和DNA的结合1、四聚体LacI蛋白的两个单体通过DNA结合结构域与Lac操纵子的O1区（中心位于+11）紧密结合，结合位点为反向重复序列。2、另一个二聚体的DNA结合结构域与O2（中心位于+412bp处）或O3（中心位于-82bp处）疏松结合，将DNA拉成环状。阻遏蛋白lacI与DNA的结合是通过异构调控来调节的阻遏蛋白结合诱导物后构型的变化：1、阻遏物由两个二聚体组成四聚体；2、二聚体的两个DNA结合域可以同时插入DNA大沟的两个相邻连续转角；3、诱导物（异乳糖）结合，改变了DNA结合域和核心区之间的角度方向，使二聚体两个头部不能同时和DNA结合，从而降低和操纵基因的亲和力诱导物改变LacI在DNA上的分布，而不是产生游离阻遏蛋白：随机DNA序列和阻遏蛋白也具有亲和力，但比操纵基因和阻遏蛋白的亲和力低107倍诱导物和阻遏蛋白结合时，阻遏蛋白和操纵基因的亲和力下降，所有阻遏蛋白结合在DNA的随机序列上（并不形成游离蛋白质）除去诱导物后，阻遏蛋白恢复活性，从随机位点直接转移到操纵基因上阻遏蛋白总是与DNA结合在一起问题乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下，也有本底水平的基因表达（约为诱导时表达水平的0.1%左右），这是由于LacI与O也偶尔解离，使细胞中有极低水平的β-半乳糖苷酶及β-半乳糖通透酶生成。1、抑制子LacI——负调控2、葡萄糖——抑制Lac操纵子葡萄糖的存在可防止从培养基中吸收其它碳源。当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻3、CAP-cAMP复合物——正调控Lac操纵子的调控因子异乳糖诱导物乳糖重排β-半乳糖苷酶透性酶转乙酰酶RNA聚合酶LacI单体LacI四聚体lacI介导的lac操纵子基因表达的负调控机制PEP,磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸PEP提供磷酸基团，EnzymeI(E1)直接被PEP磷酸化，磷酸化的E1将它的磷酸基团转移到HPr（磷酸载体蛋白），磷酸化的HPr是所有酶II（IIAGlc,IIB,IIC,IID）的磷酸基团供体：磷酸基团从HPr转移到EIIAGlc,再到EIIB,最终到达连接了葡萄糖的EIIC（有时会带上一个额外的链EIID），使葡萄糖发生磷酸化。EIIAGlcEIIAGlcIIAGlc是葡萄糖专一的酶II，具有多种调节的相互作用。它影响腺苷酸环化酶、甘油激酶和非PTS通透酶（如：β-半乳糖通透酶）的活性磷酸转移酶系统（PhosphotransferaseSystem，PTS）：单糖转运系统葡萄糖抑制Lac操纵子的分子机制β-半乳糖通透酶葡萄糖对Lac操纵子的分解代谢阻遏(catabolicrepression)：IIAGlc由于葡萄糖转运而去磷酸化，导致其结合β-半乳糖通透酶，从而阻止乳糖进入细胞。Lac操纵子的正调控因子功能：感知葡萄糖的缺乏，并通过激活lacpromoter，使RNA聚合酶结合并转录结构基因。lacoperon的正调控因子为一个复合体：cAMP结合其受体（cAMPreceptorprotein,CRP）。CRP又称为“降解代谢物激活蛋白”（cataboliteactivatorprotein,CAP）环化AMPcAMP-CAP复合物正调控的操纵子：lac,gal,ara等CAP对cAMP介导的b-半乳糖苷酶的激活至关重要提取wild-type和mutant的细胞提取物，分别加入不同量的cAMP进行体外生产半乳糖苷酶；过多的cAMP间接抑制了半乳糖苷酶体外表达的某些步骤转录激活因子CAPcAMP-CAP与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，形成一个“环状”结构，lacI无法与O相结合，易于形成转录起始复合物，只要有这个“环”的亚基存在，lacoperon就可以得到表达。cAMP-CAP还能直接和RNAPol相互作用，影响RNA聚合酶的活性。CAP-cAMP-DNAcomplex.Science2002Cell1994CAPcAMP/CAP的调控活性受ⅡAGlc蛋白的影响：ⅡAGlc蛋白的磷酸化形式可激活腺苷酸环化酶，当葡萄糖进入细胞时ⅡAGlc蛋白发生去磷酸化，导致腺苷酸环化酶活性降低。因此，当环境中无葡萄糖时，细胞内cAMP含量升高。腺苷酸环化酶有葡萄糖时，cAMP浓度降低，lac操纵子表达下降。由于Plac是弱启动子，只因乳糖的存在而发生去阻遏而使lac操纵子开放表达水平很低；有cAMP-CAP加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。cAMP-CAP对lac等操纵子具有强的正调控，能克服操纵子的代谢物阻遏效应。lac操纵子的强诱导条件：既要有乳糖又要无葡萄糖葡萄糖（+）；乳糖（-）：不诱导葡萄糖（+）；乳糖（+）：低诱导葡萄糖（-）；乳糖（+）：高诱导1、当lacI封闭转录时，CAP对Lac操纵子表达系统不能发挥作用；2、如无CAP加强转录，即使