3DNA复制与修复

勤不在三更五鼓功只怕一曝十寒13DNA的复制与修复DNA双螺旋结构模型的建立为DNA自我复制机制做了初步解释，即碱基互补——两条链互补，碱基配对——模板式复制。DNA复制中的问题1.细胞中的DNA是在双链螺旋的基础上进一步与蛋白质形成染色质的高级结构形式存在，而复制只在单链进行。2.在细胞周期中，DNA复制的起始和终止的调控。3.DNA分子很长，复制起始是随机的，还是固定的？4.不同DNA分子如环形、线形DNA复制如何终止。5.DNA复制的酶和蛋白因子。6.DNA复制的保真机制。7.DNA序列多态性的形成机制。8.DNA损伤及修复机制。3.1DNA复制概述为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之前，遗传信息载体必须精确地复制自己。遗传信息的载体是DNA，但许多病毒的遗传信息载体是RNA而不是DNA。3.1.1DNA复制研究选材原核细胞是研究DNA复制的最佳的实验系统。⑴细胞小，生活周期短，易在人工条件下培养，原核生物易获得各种突变体。原核生物中的大肠杆菌是在各方面研究最深入的一种。⑵噬菌体（phage）是研究复制机制的一个重要实验系统。优点：基因组小，易操作；DNA分子有线形、环形、单链和双链形式，可代表不同类型DNA的复制。如：线型，θ式，D型等复制。已研究过的典型噬菌体系统：Phageφx174,T43.1.2DNA复制的半保留性Watson和Crick发表了DNA双螺旋模型之后又紧接着发表了DNA半保留复制（semiconservativereplicationmodel）模型，这一建立在碱基互补基础上的机制，为DNA的转录、修复、和分子杂交等奠定了基础。DNA复制（replication）是在亲代双链DNA分子的每一条链上按碱基互补配对而准确地合勤不在三更五鼓功只怕一曝十寒2成一条新的互补链，结果生成两个与亲代链相同的DNA双链的过程。在半保留复制模型提出之前，普遍认为“蛋白质和核酸是彼此互补的，DNA自我复制过程是通过核酸和蛋白质的交替合成”。但Watson和Crick认为DNA自我复制时亲本链保持不变，但双链分成两半，每个亲本链作为复制的模板，子代双链含有一条亲本链和一条新合成的链。这就是DNA复制的半保留模型。当时人们对半保留模型是持怀疑态度的，因双螺旋模型中存在最大的问题是双链是如何打开的？其所需的能量从何而来？Watson和Crick也承认这是“最大的问题”。人们为了避开打开双链这个难题，又提出了全保留复制(conservativereplicationmodel)和分散(dispersivemodel)两个模型。在全保留模型中两条母链彼此结合，恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链。在分散模型中亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链”。后来通过实验证实其中半保留模型是正确的。DNA复制的3种假说3.1.2.1半保留复制在DNA的半保留复制过程中复制区域双螺旋解旋并分开，以每条单链为模板，按碱基互补配对原则，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。由于每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semiconservationreplication)。3.1.2.2半保留复制的证据①Meselson和Stahl的实验他们的同位素标记和密度梯度离心实验支持了半保留复制方式。1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA标记，而不用放射性同位素32P和14C。15N会导致DNA分子密度显著增加，这样可通过密度梯度离心将亲本链和子代链区分开来。将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代，使DNA被15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。分别取0代、1代、2代、3代的细胞，提取DNA，进行密度梯度离心，分辨重链DNA、正常的轻链DNA和包含一条重链和一条轻链的DNA“杂种链”。离心后从管底到管口DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处，紫外光下可以看到形成的勤不在三更五鼓功只怕一曝十寒3区带。14N-DNA密度较轻，停留在离管口较近的位置；15N-DNA密度较大停留在较低的位置。当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养1代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间。培养2代后则在14N-DNA区又出现一条带。有等量的“杂种链”和轻链密度。这些结果只与半保留复制模型相符。全保留模型可以排除，但分散模型却不能排除。Meselson等又将第1代的14N/15N杂种链变性使双链分开，再将变性前后的双链和单链分别进行CsCl密度梯度离心。变性前杂种双链只有一种带，密度为1.717g/cm3，变性后两条单链的密度不同而呈现了两条带，一条为15N带，（1.740g/cm3），另一条为14N带（1.725g/cm3）。作为对照的是从肺炎球菌（D.pneumoniae）中提取的DNA，变性前后都只有一条带，密度为1.700g/cm3。这一结果完全符合半保留复制预期的结果，并否定了全保留模型和分散模型。按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N和14N/15N两种DNA分子，随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。而14N-15NDNA区带逐渐减弱。②Taylor的实验真核细胞的每条染色单体是由一条DNA双链组成，1958年HerbertTaylar用3H的胸腺密啶核苷酸处理蚕豆根尖细胞8小时，然后移入含有秋水仙素而没有标记放射性的培养液中。经标记处理后第一次分裂中期的染色体周围均显示放射性，每个染色体中有一条染色单体被标记，另一条染色单体未被标记。第二次分裂中期的染色体就只有一个显示有放射性，而另一个却没有。证明真核DNA复制也符合半保留模型。③姐妹染色单体差别染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）在复制过程中用胸腺嘧啶的类似物5-尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，BUdR）可掺入到新合成的DNA中。在两细胞周期之后，一条染色单体中含有DNA分子的双链都被BrdU取代，而另一条染色单体只有一条DNA单链中含有BrdU。若用荧光染料染色，DNA双股都含有Brdu的染色单体的荧光强度要小于DNA的单股含BrdU的染色单体的荧光强度，在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体的荧光强弱不同。若用Giemsa染色，当双链都插入5-BudR时则染不上Giemsa，而一条插入5-BudR则可染色。若细胞的培养基加入5-BudR则第二复制周期时，两条姊妹染色体染色状况不同，一明一暗，称花斑染色体。勤不在三更五鼓功只怕一曝十寒43.1.3DNA复制过程的顺序性3.1.3.1边解链边复制DNA的复制是边解链边合成从SV40复制的早期电镜照片可见复制部分和未复制部分。3.1.3.2复制起点DNA复制是从DNA分子上特定位置（原点，origin）开始，此位置称复制起点(Originofreplication，ori)。复制起点（origin）是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌体、细菌染色体、质粒和一些动物病毒的DNA通常具有明显的复制起点。酵母也有特异的复制起点，在细胞周期S期染色体复制时起重要的作用。真核生物的复制起点很复杂，现在还难于在分子水平上阐明其特征。大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一个Ori位点，而真核生物染色体中有多个Ori。例如，果蝇染色体DNA约有3000个Ori位点，酿酒酵母第17号染色体中至少有400个Ori。3.1.3.3复制方向DNA复制方向的可能性。研究DNA复制的方向常用温度敏感性变异菌株结合放射自显影技术。大肠杆菌的一个温度敏感株在42℃时能使DNA在完成复制后不再开始新的复制过程，而在25℃时复制功能恢复。将此温度敏感株在同一时间开始复制，细菌同步生长。先将这种同步生长的突变株在含高比度3H-TdR中生长几分钟，再移入低比度3H-TdR中作脉冲标记。然后对菌体DNA作放射自显影分析。若复制是单向的，仅有一个高比度区，且高比度与低比度的放射性分布应该邻近。若复制是双向的，有两个分离的低比度放射性分布区。DNA可进行单向和双向复制，大多数DNA的复制是双向的。有些病毒（如腺病毒、Φ29噬菌体等）及线粒体DNA的复制是单向进行的，滚筒式属单向复制。SV40为5224bp的环形分子，有1个EcoRⅠ切点。中用EcoRⅠ酶切复制中的SV40得到复制眼大小不同的系列DNA分子，可见随复制眼扩大两侧DNA变短，说明复制从原点开始双向复制。真核一般为多起点复制。也可利用变形对DNA电泳迁移的作用来确定复制原点。例如用二维作图方法，即复制中DNA的限制性片段在第一维方向进行电泳，按分子量的大小勤不在三更五鼓功只怕一曝十寒5分离。再在第二维方向电泳，第二维方向电泳移动主要由形状决定。不同复制中分子会有不同的路径，这可以通过它偏离双倍大小线形DNA分子的路线的程度来确定。复制起点的位置和复制叉的数目决定了限制性复制片段的形状，这些形状可通过不同的电泳路迹(实线)显示出来。虚线显示线形DNA的电泳路迹。DNA正在复制的分叉部位称为复制叉（replicationfork）非复制DNA的旁边复制的DNA在电镜下象只眼睛称复制眼（泡）3.1.4DNA的半不连续复制DNA复制是半保留复制，且是半不连续复制(Semi-discontinuousreplication)。DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是5’→3’方向，另一条是3’→5’方向。DNA复制时，新生链延伸方向一条为3’→5’，另一条为5’→3’。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5’→3’延伸。3.1.4.1半不连续复制的证据Okazaki（冈崎）于1968年通过H3–脱氧胸苷（H3–dT）标记实验证明了半不连续复制。①实验材料T4感染的E.coli：野生型phage–T4；mutantT4（连接酶突变）②实验系统H3–dT标记E.coli；phage–T4感染；密度梯度离心。检测标记DNA在不同时间合成的情况。③实验结果：短时间内，首先合成较短的DNA片断（冈崎片段），接着出现较大的DNA分子。突变型连接酶T4中，大片段DNA很少或无。半不连续合成，放射性标记一半出现于短片段（冈崎片段），另一半出现在长片段DNA中。④结论：DNA复制是半保留半不连续复制。3.1.4.2半不连续复制在复制起点两条链解开形成复制泡(replicationbubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replicationforks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3’→5’，以此为模板的新生DNA链合成沿5’→3’方向连续进行，这条链称前导链(leadingstrand)。另一条模板链的方向为5’→3’，以此为模板的新链合成方向也是5’→3’，但与复制叉前勤不在三更五鼓功只怕一曝十寒6进方向相反，且是分段的不连续合成，这条链称滞后链(laggingstrand)，合成的片段为冈崎片段(Okaxakifragments)。冈崎片段由DNA连接酶连成完整的DNA链。前导链的连续复制和滞后链的不连续复制，称为DNA合成的半不连续复制。3.1.5复制子DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止。①复制子(replicon)复制子或复制单元是基因组中具有一个复制起点（origin，ori）和一个复制终点（terminus，ter）并能在细胞中自主复制的单位。②原核生物中，只有一个复制原点，每个DNA分子上只有一个复制子；③真核生物中，每个DNA分子有多个复制子，每个复制子长约50-200kb；其DNA复制是由多个复制子共同完成的。每个细胞中，染色体DNA复制子一般只复制一次。大肠杆菌DNA复制1次需42min；人类复制叉前进100bp/s，复制整个基因体需8hr；果蝇复制整个基因体仅需3~4分