3基因表达检测

第三部分：基因表达检测基因表达检测的应用范畴检测自然变异等位基因的表达差异；检测突变体基因功能的丧失或获得；检测转基因的表达：OX&抑制&突变。基因表达检测的技术手段RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)Real-timePCR=qRT-PCRNorthernBlottingRT-PCR(qRT-PCR)RNA抽提cDNA反转录基因特异性引导Oligo(dT)引导随机六核苷酸引物引导PCRNorthernBlotting基因表达分析的一般流程NorthernBlottingInventedbyKaryMullisin1983andAwardedNobelPrizeforChemistryin1993基因表达水平mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR；RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理总RNA提取RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的；RNA的纯度和完整性对于Northernblot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要；RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。被污染的试剂，缓冲液移液器使用的器皿及tip等操作者的手、口、头发等RNA操作中应注意的关键问题：防止RNase污染外源RNase的主要来源：1.处理并专用：移液器、玻璃器皿、离心管、枪头、溶液、缓冲液、RNA电泳装置用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后，有的再高压蒸气灭菌15min，烘干备用；2.180－300ºC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品；3.也可使用新的、无RNA酶的一次性tubes,tips等；4.在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。防止外源RNase污染的主要措施1.材料要新鲜、取样离体时间要短并快速冷冻；2.裂解过程要同RNase活性抑制同步：快速冷冻。防止内源RNA酶降解RNARNA酶抑制剂RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：1.DEPC（焦碳酸二乙酯）：形成组胺基团破坏RNase的活性；2.氧钒核糖核苷复合物：能与多种RNA酶活性位点结合RNA酶；3.蛋白质抑制剂：可与RNase形成非共价的复合物。实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量实验材料：水稻幼嫩叶片苯酚/氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可配合氯化铯离心或有机溶剂提取。TrizolReagent提取方法利用Trizol试剂抽提植物总RNA原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA;用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。1.75％乙醇（inDEPC-treatedwater)2.氯仿、异丙醇（RNA专用）3.RNase-freewater：DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate（DEPC）to0.1%.Letstandovernightandautoclave.4.防止外源RNase的污染：应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs以上；一次性用品如tube、tip、塑料制品等使用DEPC蛋白质变性剂处理，或者用新的、无RNA酶的产品；电泳槽相关的用0.4M的NaOH处理，再用DEPC水洗3遍。RNA抽提前应准备的其它试剂及物品操作步骤•液氮取样，液氮磨样，每管分装0.1克样品；•每管加1mlTrizol试剂（样品体积不超过Trizol试剂体积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；1.加200µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；2.2-8℃，12000g离心10-15分钟；3.将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml异丙醇室温下沉淀10分钟（或加入2倍体积无水乙醇-20℃放置2h以上）；3.2-8℃，12000g离心15分钟，弃上清，加1ml75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500g离心5’，小心弃上清；5.室温静置15分钟，使RNA沉淀恰好干燥，加入20µlDEPC水于65℃水浴溶解10分钟，保存于-70℃；6.取2µl琼脂糖电泳检测RNA质量。RNA的琼脂糖凝胶电泳进行质量检测1.用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳2.用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在含6％或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳3.检测0.5×TBE4.电泳：1×MOPS（3-(N-吗啉基）丙磺酸）80—150V40min—1h有溴化乙锭存在时，电泳后28SrRNA和18SrRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5.8SrRNA和5SrRNA组成的较模糊的迁移较快的带。如果RNA没有降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。WhatdoesgoodorbadtotalRNAlooklikewhenseparatedingel?DegradationContaminantGood？CallusLeafRNA降解的主要原因1.取样后没有立即抽提RNA；2.抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；3.样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70℃，而不是-20℃）；4.使用的溶液或器皿有RNase污染；5.琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5。RNA产量低的原因1.样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底2.RNA没有完全溶解DNA污染的原因样品太多，所加试剂相对太少用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等），或碱溶液等RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程实验材料：水稻幼嫩叶片RNA目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理DNaseI:是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5’－P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。体外转录后除去模板DNA。反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。如常见的鼠白血病毒反转录酶M-MLVRT的两种关键酶本实验以水稻叶片RNA为材料，检测水稻种子大小基因GS5突变体(或内源任意基因)的基因表达；实验中设置一个内参基因作为阳性对照，判断RNA的定量及反转录、PCR等过程是否有问题；设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；同时设置一个以叶片DNA为阳性对照，检验扩增带型是否来源于反转录的cDNA。实验设计操作步骤（一）RNAPreparation1.PreparetheplanttotalRNAbyTRIzolReagent；2.TesttheRNAconcentrationbyNano2000；3.Combinethefollowingina0.5mlsterileeppendorftube:TotalRNAxl(~5g)RNase-freeDNase１l(１u/l)10×DNasebuffer1laddDEPC-treatedddH2Oto10l4.Incubateat37℃orroom-temperaturefor15min,thenadding50mMEDTA1land,incubatedat70℃for10mintoinactiveDNaseI；操作步骤（二）ReverseTranscriptaseReaction5.500g/mloligo(dT)151l5×firststrandbuffer4l10mMdNTP1lM-MLV(200U/l)1lRNaseInhibitor1lDEPCH2O1l20l6.incubateat37℃for1h.(Thetotalvolumeshouldnowbe20l)；7.Inactivethereactionbyheatingat70℃for10min,thenthefirststrandofcDNAcanbeusedasatemplateforamplificationinPCR；add20-60ulddH2O;-20-70℃;8.ToremovetheRNAcomplementarytothecDNA,add1l(2units)ofRNaseHandincubateat37℃for20min.1.在冰上配制下列反应体系:FirststrandcDNA2lTaq(5u/1l)0.3l10×ExTaqbuffer2ldNTPmixture(2mM)2lPrimerF(10mM)0.25lPrimerR(10mM)0.25lddH2O13.2l操作步骤（三）:PCR2.PCR反应循环条件设置：根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如扩增片段的长度及mRNA的丰度等；3.检测：加2l溴酚蓝，混匀，取15l反应产物电泳；4.在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。1.Taq酶过多；2.Mg2+浓度不合适：Optimize[Mg2+]inaladderof0.5mM;3.引物不特异、浓度过高、Tm值过高、引物形成二聚体;4.复性温度过低：三度幅度梯度提高;5.循环次数过多；6.模板量过多。PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因1.点样或染胶问题;2.反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时出了问题；3.目的片段太大，使用的DNAPolymerase无法扩增出目的片段；4.DNA溶液中或反应体系中含有Taq酶抑制剂；5.退火温度太高；6.Taq酶活力不够或其他试剂有问题；7.引物设计不合理，与模板不配对等。导致PCR产物很少或无扩增产物的原因（李一博等，2011）RT-PCR与Northern杂交分析结果示意图（GS5）Lietal.NatGenet(2011)Real-timePCR=QuantitativeRT-PCR(qRT-PCR)1.至少三个生物学重复;2.提取高质量的、完整的RNA(A260/A2801.8且A260/A2302.0)；3.去除基因组DNA;4.所有的测验汇总使用相同的引物策略与反应条件;5.利用内参基因来检测cDNA的质量与产量;6.设计基因特异的PCR引物;7.通过最小化和规范化实验步骤来减少技术误差;8.至少用4个文献中已报道的内参基因;9.对每一个样品的测试基因与内参基因进行平行的测试;10.确定哪一个内参基因对所有样品均是最优的内参;11.综合考虑内参与测试基因的PCR效率和Ct值来计算表达水平。ElevenGoldenRulesofQuantitativeRT-PCRUdvardiMKetal.PlantCell20:1736-1737(2008)重点1.RNA的抽提：降解的原因、质量的好坏；2.RT-PCR、qRT-PCR的原理及注意事项。总成绩：平时实验占50%+实验报告占50%写三个综合性实验的实验报告，实验报告