3动物细胞工程制药

第三章动物细胞工程制药微生物与生化制药实验室张革第一节概述一、动物细胞工程的发展简史1907年，Harrison首先培养了神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞(神经纤维)，他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志。1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于细胞培养的生长促进作用，并首次把无菌技术引入细胞培养技术中。1950年后Earle等分别建立了Hela等多种细胞系(cellline)动物细胞培养从50年代起步，已成为普遍技术新的核酸技术，免疫，电泳等技术使细胞培养技术从细胞水平进入分子水平1986年，传代细胞Namalwa（Burkitt‘s淋巴瘤细胞）生产的干扰素批准临床猴肾细胞Vero生产疫苗1987年，杂交瘤细胞生产抗体1988年后，传代细胞生产基因工程产品t-PA、EPO、VIII二、动物细胞工程制药的基本概念（一）动物细胞工程制药目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80%，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等动物细胞工程制药包括：培养细胞获得多肽和蛋白药物转基因动物生产疫苗，多肽和蛋白药物动物细胞培养的产物疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂β-细胞生长因子、INT、白细胞活化因子、血清胸腺因子、IL、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶uPA、Asn酶、胶原酶、P450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tyr脱羟酶等激素HCG、EPO、促滤泡激素、GH、促间质细胞激素、促黄体激素等动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、动物细胞反应器，动物克隆，染色体改造，基因转移，转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面最基本的有细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术三项技术（二）动物细胞的分类1.贴壁依赖性细胞:包括成纤维细胞型，上皮细胞型。生长于支持物表面。上皮细胞型成纤维细胞型2.非贴壁依赖性•也称悬浮细胞•这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织，许多肿瘤细胞等均属于此类。细胞一般呈圆形。悬浮细胞3.兼性贴壁细胞•有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。兼性贴壁细胞（二）动物细胞培养的环境条件1.温度。2.Ph。7.2-7.4酚红3.通氧量，需CO24.防治污染。支原体、抗生素。5.基本营养物质6.渗透压（三）动物细胞的培养特征1.比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差。2.倍增时间长，生长缓慢，易污染，培养时添加抗生素3.培养基要求高，易污染。4.培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在。5.产物分泌性6.蛋白后修饰动植物细胞培养与微生物培养性能的相比项目哺乳动物细胞植物细胞微生物细胞大小[μm]悬浮生长营养要求倍增时间[h]细胞分化环境的敏感性产物存在产物浓度（%）产物种类10～100可以，多采用贴壁很复杂15～100有非常敏感胞内或胞外低疫苗、激素、抗体、生长因子、免疫调节剂等10～100可以，但细胞易聚集复杂15～100有限分化敏感胞内低酶、生物碱、天然色素、有机化合物等1～10可以简单0.5～5无一般胞内或胞外高发酵食品、抗生素、有机化合物、酶细胞培养基本技术1.原代培养（1）组织块培养法（2）单层细胞培养法动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液10代细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系2.传代培养3.克隆培养饲养细胞细胞的冻存与复苏在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。低温保存的关键：在于通过0~-20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下：形成冰晶。如果缓慢冷冻，逐步脱水，不致产生大的冰晶复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。常用的低温保护剂是DMSO，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，减少胞内冰晶，第二节生产用动物细胞一、生产用动物细胞的获得（一）非基因工程细胞的获得1.原代细胞(primarycell)直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液1g组织约有109个细胞增殖能力有限，需要大量的动物才能增加产量，费钱费劳力,限制了它的应用。动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等适合药物检测2.传代细胞系(passagecell)原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株(continuouscelllines,CCL)。染色体组型是2n的核型,二倍体细胞系具有贴壁依赖和接触抑制的特性有限的增殖能力，50代无致瘤性一般从胚胎中获得，有限传代WI-38,MRC-5,2BS等。WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系传代细胞在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处,有时是从肿瘤细胞衍生而来,由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性,因而数十年间未允许传代细胞用于生产。70年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性现在CCL已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。3.转化细胞系(transformantcell)通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点。由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖的能力自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物人为转化：采用某些病毒SV40或某些化学试剂从动物肿瘤组织中建立的细胞系转化细胞为永生化细胞，无限细胞系，连续细胞系转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求低，更适于大规模工业化生产在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延长细胞周期,提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量。Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞。（二）基因工程细胞系的构建在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和采用基因工程手段构建的各种工程细胞基因工程细胞系：用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系分杂种细胞(hybridcell)和重组细胞(reconstitutedcell)（1）杂种细胞的构建：通过细胞融合技术构建的动物细胞融合：合并为双核和多核细胞的过程不同基因型的细胞融合为异核体(heterokaryon)核体经有丝分裂和染色体重排，可形成具有新的遗传性状的单核杂种细胞，合核体(synkaryon)(1)细胞融合（cellfusion）：正常情况下，因有完整的细胞膜，两个接触的细胞不发生融合诱导物可导致细胞融合：仙台病毒聚乙二醇物理方法：电击法，激光法仙台病毒融合法仙台病毒属于副黏病毒科，副流感病毒I型，RNA病毒病毒表面有神经氨酸酶，降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞粘在病毒周围，细胞互相渗透，融合目前很少使用聚乙二醇融合法PEG结构式：HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH分子量200-6，000常用分子量1000，浓度50%，pH8.0-8.2原理：50%的PEG，与临近膜的水相结合，导致双脂层的不稳定，使膜发生融合主要用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备电融合法细胞在短时间的强电场作用下，膜发生可逆性的电击穿，使相邻细胞的膜发生继发性融合操作简便、无化学毒性、细胞损伤小、融合同步、融合率高可比PEG高10-20倍可在显微镜下直接观察融合过程用于小鼠骨髓瘤细胞的融合，构建大量生产人源单克隆抗体的淋巴杂交瘤细胞株还可用于真核细胞与原核细胞、动物细胞与植物细胞的融合（2）杂种细胞筛选细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合体细胞和未融合的亲本细胞筛选方法：（1）营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为融合的亲本细胞，选择培养基来筛选（2）利用或人为制造两个亲本细胞的物理差异，如大小，密度等进行筛选（3）利用或人为制造杂种细胞与未融合细胞生化或分生能力的差异，进行筛选2.重组细胞的构建（基因工程细胞系）在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和采用基因工程手段构建的各种工程细胞包括CHO，BHK-21,SP2/0，Vero细胞等最多用的是CHO目前用重组DNA术改造的CHO细胞生产INF、IL、EPO、单抗以及protein药品已成为国际医药市场上的热销产品，但这些产品的生产规模普遍较小(大多为5-50L的小型罐)（1）表达载体的构建外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在高效表达载体内，表达载体两类：a.病毒载体，牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒b.质粒载体——穿梭质粒载体a.病毒载体牛痘病毒载体：大容量，广泛地用来构建多价疫苗(重组牛痘多价活疫苗)。表达外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒腺病毒载体和反转录病毒载体：正被适用于基因治疗中杆状病毒载体：可感染多种哺乳动物细胞，生物安全度高，已成功地用于300多种外源基因的高效表达。用杆状病毒进行蛋白质的高效表达b.质粒载体穿梭质粒:能在两种或两种以上宿主中复制的质粒基本成分：允许载体在细菌内扩增的质粒序列，包括起始位点和抗生素标记基因序列；能使基因表达的调控元件，包括TATAbox，CAATbox和增强子，终止序列、3’端切割序列和polyA序列；选择标记，一类是仅适用于密切相关的突变细胞株，一类是显性作用基因，如新霉素抗性基因(neo);带有选择性增加拷贝数的扩增系统，常用的是二氢叶酸还原酶系统，谷氨酰胺合成酶系统和腺苷脱氨酶系统。（2）基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选DNA-磷酸钙沉淀法溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。Na2HPO4溶液+溶解的DNACaCl2溶液逐渐加入磷酸钙沉淀DNA被包裹在沉淀中DNA磷酸钙共沉淀物通过细胞吞噬作用将DNA导入优点：方法简单可进行共转化廉价电穿孔法电穿孔仪产生高压脉冲电场细胞膜出现瞬时可逆性小孔外源DNA沿着小孔进入细胞优点：转染效率高缺点：进入细胞的DNA拷贝数较低最佳条件：电场强度、脉冲形状、电穿孔介质等筛选外源基因导入效率很低，必须从大量的细胞中进行筛选利用选择标记，采取相应的筛选系统：Neor:G418tk+：胸腺嘧啶激酶hgprt+：次黄嘌呤营养缺陷型受体细胞第四节、制药工业中常用的动物细胞FDA规定：除原代细胞外，其他细胞株或细胞系一旦建成后必须进细胞库保存工程细胞必须建立原始细胞库(mastercellbank,MCB)：单一来源的均质细胞原始细胞库所有细胞必须建立档案（细胞系历史），进行无菌，无交叉污染和各种有害因子（细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等）的检测生产细胞库（manufacturer’scellbank,MWCB,工作细胞库)：从MCB来的，或从单一安瓿来的，或从多个安瓿混合在一起的，经培养扩增达到一定数量后，再分装储存形成的细胞库需建立档案,确定最高使用代数,进行无菌和细胞交叉污染检查用于重组的常用细胞株：BHK12细胞C127细胞CHO-K1细胞COS细胞MDCK细胞MRC-5细胞Namalwa细胞Sf-9Vero细胞WI-38细胞SP@/0-Ag14细胞来源特性培养