3物理图绘制

第三章物理图绘制用遗传学技术作图对于指导基因组计划的测序阶段还是远远不够的，因为遗传图谱的局限性：1.遗传图的分辨率有限：依赖于所得到的交换数目。2.遗传图的覆盖面较低：重组热点、极少重组区段的存在。3.遗传图的准确率有限：环境因素和取样误差，分子标记的排列有时会出现差错。物理图谱是以物理距离来表示各遗传标记之间或DNA序列两点之间在DNA分子上的位置，以实际的碱基对长度来度量其物理距离。1）限制性作图（Restrictionmapping）：它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。2）基于克隆的基因组作图(Clone-basedmapping)：根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig),绘制物理连锁图。3）荧光原位杂交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）：将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。4）序列标签位点作图（Sequencetaggedsite,STS）：通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因组的DNA区段中。物理图绘制方法3.1限制性作图限制性内切酶：1.Ⅰ型限制性内切酶：催化宿主DNA甲基化，在识别位点约1000bp以外任何位置切割DNA链，不产生确定限制片段和明确条带2.Ⅱ型限制性内切酶：在识别位点之中或邻近的确定碱基位置特异性切开DNA链，产生确定的限制性片段和条带，是3类限制性内切酶中唯一可用于限制性作图的酶3.Ⅲ型限制性内切酶：催化宿主DNA甲基化，在识别位点约25-27bp何位置切割DNA链，要求识别位点是反向重复序列，很少产生完全酶切的片段3.1.1限制性作图的基本方法•比较一种DNA分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。•首先用一种酶处理样品后，电泳确定DNA片段的大小。•然后用第二种酶处理，获得第二组片段。•最后用两种酶混合处理，获得第三组片段。•收集上述资料进行对比组装。•两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。•连续出现2个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法（多个相同酶切位点区段只发生一次酶切）。•切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。§3Physicalmapping§3.2限制酶作图限制酶作图的基本方法8结论：图谱II是正确的双限制性酶切图解片段结论0.2kb,0.5kb必然来自0.7kb的BamHI片段，其中有一个EcoRI的位点1.0kb这必然是一个不含EcoRI位点的BamHI片段，如果我们如下放置1.0kb的片段，就可以解释1.5kbEcoRI片段的出现1.2kb,2.0kb这必然也是不含EcoRI位点的BamHI片段，它们必须位于3.4kb的EcoRI片段中。这样就有两种可能：BamHI部分限制性酶切的预测如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括1.2+0.7=1.9kb的片段如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括2.0+0.7=2.7kb的片段BamHI亚适条件限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作图更适合于小分子。实际应用中如果DNA分子小于50kb，通常可以选用识别6个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。一个较简单的变通策略使我们可以忽略大量的片段。这种方法是将标记物加到要分析的DNA分子两端，进行部分酶切处理后，很多产物成为不可见的，我们利用可见的部分大小，确定那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。末端同位素标记（或其他标记）结合部分酶切：形成梯形分布带3.1.2限制性作图的局限如果基因组较大，切点较多，单、双、部分酶切的片段会很多。限制性作图只能应用于较小的DNA分子。通过选择靶DNA分子中的稀有酶切位点酶可以克服限制性酶切作图的局限性。稀有切点限制酶:在基因组DNA顺序中只有很少可识别序列的限制酶,一般识别位点在6-8碱基对之间,并含有高G/C比。稀有切点限制酶分为两大类：识别具有7或8个核苷酸序列的酶；识别序列包含靶DNA稀少基序的酶。稀有切点限制图绘制•识别顺序越长产生的片段越大，但当识别位点含非特异顺序时，片段长度小于预期；•识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因组一般A/T比较高,应选G/C高比例限制酶,如-GCGGCCGC-(NotI)•限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种序列，可以通过转座或转导将这类酶切位点引入待测基因组；•基因组DNA甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基因组DNA甲基化比例很高,但果蝇和酵母基因组无甲基化。稀有切点限制酶选用稀有切点限制酶酶切大片段DNA预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小1)根据稀有酶切位点限制酶识别碱基数推测产生的DNA片段长段:NotI酶:GC/GGCCGC48=74536bp=75kbI-SceI酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT418=90000000bp=90000kb2)由于多细胞真核生物基因组DNA存在大量的甲基化位点,识别CG序列的稀有酶切点限制酶实际产生的DNA片段比预期大得多.如NotI酶切人类基因组DNA产生的片段常在200kb以上，平均长度达到1Mb。PFGE的基本原理将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电场，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10Mb。常规琼脂糖凝胶电泳可分辨30kb以下的线性分子，脉冲凝胶电泳可分辨10Mb的大分子大片段DNA的分离技术——脉冲凝胶电泳常规与非常规琼脂糖凝胶电泳正交变电场凝胶电泳3.脉冲凝胶电泳垂直交变电场电泳垂直交变电场(OFAGE)，有2对电极，分别位于凝胶对角线的两端，2对电极轮流接通电场，产生一个交替的方向不同的电场，DNA分子在凝胶中不断改变迁移方向。交变电场电泳主要用于相对分子量较大的DNA分子的分离。均一脉冲电泳大肠杆菌基因组物理图3.2基于克隆的基因组作图---大分子DNA的克隆基于克隆的基因组作图：根据克隆的DNA片段之间的重叠序列构建重叠群(Contig)，绘制物理连锁图。3.2.1载体•质粒、噬菌体、粘粒……•啤酒酵母基因组主要是先构建粘粒文库，然后建立克隆重叠群完成测序•高等生物基因组–拟南芥1.2X105bp，需要25000个克隆–人类基因组是拟南芥基因组的33倍3.2.1大分子DNA克隆载体常规的质粒载体不适用于大分子DNA的克隆。大分子DNA克隆载体构建:YAC,BAC,PAC酵母人工染色体（YAC）端粒：用于保护线状的DNA不被细胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。着丝粒：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。自主复制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。端粒YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb，有的可达1Mb以上。YAC载体的工作原理YAC的主要缺点：1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构;4．转化效率低。•噬菌体P1载体：与λ载体相似，将天然噬菌体基因组中的一段区域缺失，容量达125kb•细菌人工染色体BAC：由大肠杆菌中F质粒衍生，容量达300kb，单拷贝复制，稳定，不会因重组发生嵌合•P1人工染色体PAC：结合P1载体和BAC载体的优点细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。选择标记：氯霉素抗性基因等。BAC载体的优点：较为稳定；没有嵌合现象；转化效率高；BAC克隆易于操作和DNA提取；BAC文库筛选方便。质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征基因组文库：指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了某种有机体整个基因组。1)目标基因组大分子DNA的制备；2)载体制备；3)载体和DNA的连接；4)转化；5)转化子鉴定。YAC和BAC基因组文库的构建目标基因组大分子DNA的制备样品→洗涤吸干水分→液氮冷冻→碾碎→离心收集细胞核→低融点琼脂糖包埋→蛋白酶消化→洗涤→限制酶部分酶解插入大分子DNA的分离载体制备与插入DNA连接1)YAC载体：制备过程与一般质粒载体相同。2)BAC载体：低拷贝载体，大量制备，超离心纯化。3)酶切：释放接头，接头去磷，减少自连。4)连接：将含有大分子DNA的琼脂糖薄片与载体混合,按重量比1:1，680C保温5min，降温至370C，加入连接酶过夜。染色体步移3.2.2重叠群组建相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群(contig)。构建重叠群：步移法和指纹法3.2.3指纹作图—3种指纹在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的方法是克隆指纹排序。指纹指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段组成。指纹重叠，表明2个克隆具有共同的区段，两个片段相邻排列。•指纹作图–限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列–重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂交带型，说明重叠–重复序列DNAPCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克隆进行PCR扩增，相同的产物，说明重叠–STS目录作图：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克隆进行PCR扩增限制性片段指纹作图原理限制性片段指纹电泳图指纹重叠群构建3.3原位染色体连锁图原位染色体连锁图：通过原位杂交的方法将基因或DNA分子标记定位在染色体的某一区段，由此绘制图称为原位染色体连锁图。最常用的细胞图绘制技术为荧光原位杂交。（fluorescentinsituhybridization,FISH）原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完整染色体的一种杂交分析方法，其必须使染色体DNA成为单链。荧光原位杂交原位杂交的操作染色体分裂细胞染色体变性检测信号早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。20世纪80年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探针至少40kb。现在由于强信号荧光物质的发现和重标记技术的发明，对探针长度的要求已经不那么严格了。甲酰胺处理加入探针一种封闭杂交探针中重复序列的方法如何提高荧光原位杂交的分辨率？原位杂交的分辨率与染色体的制备有关：中期染色体：过于收缩，其分辨率1000kb，主要用于发现新的分子标记属于哪条染色体；机械伸展的中期染色体：离心可使中期染色体伸张，保持形态，提高分辨率200—300kb；非中期染色体：松弛状态，分辨率可达到25kb以下，