生物52《多聚酶链式反应扩增DNA片段》课件(新人教版

多聚酶链式反应扩增DNA片断一、基础知识（一）DNA分子的结构C、H、O、N、P1、组成元素脱氧核苷酸2、基本单位3、脱氧核苷酸结构脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端4、多脱氧核苷酸链得形成碱基OHOOPOHOOHOOPOHO碱基OHOHOOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5’3’3’5’碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’多脱氧核苷酸链结构简图5′5′3′3′6、利用碱基互补配对规律的计算规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%，（A+G）/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G)＝1规律二：在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与另一条互补链的(A+G)/(T+C)的值互为倒数关系规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等（二）DNA分子的特性1、稳定性在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25％，A和T占75%，哪一个稳定？答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分子中含有较多的G－C碱基对比含有较多的A－T碱基稳定2、多样性构成DNA分子的碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化例题：如果有4000个碱基对，碱基对有多少种排列方式？答：碱基对排列方式有44000种3、特异性不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的（三）DNA的复制2、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体4、模板DNA母链1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程5、原材料脱氧核苷酸6、基本条件酶、ATP、原料、模板7、复制过程①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链②RNA引物的合成以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成冈崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断⑤DNA片断的连接在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA边解旋边复制(过程）8、复制特点半保留复制（结果）9、遵循原则碱基互补配对原则10、精确复制的原因11、复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行①一条双链DNA分子，复制N次，形成的子代DNA分子中，含亲代DNA母链的有两个DNA分子，占子代DNA总数的2/2N；亲代DNA分子母链两条，占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的2/2N+1=1/2N②设一条DNA分子中有胸腺嘧啶为m个，则该DNA复制n次后，形成子代DNA分子需游离的胸腺嘧啶为T=(2N-1)m12、DNA复制过程中的等量关系（四）PCR(多聚酶链式反应）1、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物2、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸3、PCR原理①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化4、TaqDNA聚合酶的应用5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出6、PCR技术的特点7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液①PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸8、细胞内复制和PCR不同点②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的（五）PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链PCR循环第三步：引物延伸第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循环后靶序列扩增的数量4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸二、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪微量离心管微量移液器循环数变性复性延伸第一次94°C，10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头（一）理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2、过程①稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③计算④计算DNA含量（g）＝50x(260nm的读数）x稀释倍数50：1g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02比色杯五、实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃