3紫苏提取物抗氧化活性体外实验研究040223

第1页共6页KSBIO-NO.0305《中国食品添加剂》第22页紫蘇提取物抗氧化活性體外實驗研究吕晓玲朱惠丽姜平平姚秀玲周平（天津科技大学，天津300222）摘要：紫苏是在我国广泛分布的唇形科植物，含有多种具有生理活性的化学成分，其中的迷迭香酸具有很强的抗氧化性。本文研究了紫苏提取物的制备方法、迷迭香酸含量的测定方法和该提取物的还原力、对由亚铁离子引发的卵磷脂脂质体过氧化的抑制作用以及对脱氧核糖氧化损伤的制作用，结果显示提取物中迷迭香酸含量为37.49±0.24%(质量比),并且有较强的还原力、抗氧化性和对脱氧核糖氧化损伤抑制作用。关键词：柴苏提取物，迷迭香酸，抗氧化紫苏叶为唇形科植物紫苏[Perillaefrutescens（L.）Britt.]的干燥叶，该植物主产于江苏、湖北、广东、广西、河南等地。味辛、性温、入脾肺二经。紫苏含有多种化学成分，如紫苏醛（perillaldehyde）、紫苏酮(perillaketone)、榄香素(elemicin)、石竹烯(caryophellene)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、木犀草素(luteolin)、木犀草素的7-葡萄糖苷等[1]。迷迭香酸(Rosmarinicacid,RosA)是有一定生理活性的酚酸类化合物，具有极强的清除体内自由基的活性，其抗氧化活性强于咖啡酸、绿原酸、叶酸等[2]。它对H2O2引起的大鼠红细胞溶血和脂质过氧化有显著的抑制作用[3]，对由维生素C-NADPH或Fe2+/O半胱氨酸诱发的大鼠脑、肝、肾微粒体的脂质过氧化亦都有很强的抑制作用[4]，可能是紫苏中存在的主要非酶抗氧化物质。过去常用亚油酸（linoleicacid）和亚麻酸（linolenicacid）的水相分散系来评价一些抗氧化剂的抗氧化能力，但由于亚油酸的存在会影响不同极性的抗氧化剂的浓度及其分布的水相胶束的物理特性，使得以上体系实不足以作为评价抗氧化剂的有效体系[5][6]。目前常用不饱和甘油三酯和磷脂的分散系来做评价体系。本文研究了含有迷迭香酸成分的紫苏提取物抑制脂质过氧化的作用等特性，以期对紫苏叶的营养价值有进一步了解，为开发以紫苏叶为原料的功能性食品提供依据。1材料与方法1.1实验材料干制紫苏叶（青岛鹏远天然色素研究所），卵磷脂（lecitin，B.R.，华东师范大学化工厂），硫代巴比妥酸（TBA，A．R.，上海恒信化工厂），抗坏血酸（L-ascorbicacid，A．R.，天津科密欧化学试剂开发中心），三氯醋酸（TCA，A．R.，天津市凯通化学试剂有限公司），2，-脱氧核糖（2，-deoxyribose，UltraPure，AMRESCO分），迷迭香酸标准品（BIOMOLResearchLabs．INC．）1.2主要仪器与设备高效液相色谱仪（ShimadzuLC—10AT，二极管阵列检测器SPD-M10A，日本岛津制作所），旋转薄膜蒸发器（ZFQA203，天津市玻璃仪器厂），紫外可见分光光度计（UV-9100，北京瑞利分析仪器有限公司），真空干燥箱（DZF-6020型，上海益恒实验仪器有限公司）。1.3实验方法第2页共6页1.3.1提取物的制备[7]称取紫苏叶，置于小三角瓶中，按40∶1加入水，在90℃水浴中浸提45min，两次，用纱布粗滤；合并浸提液，用18%的盐酸调pH值至2.0～2.5，进行抽滤；将清液用乙酸乙酯（溶剂比为1∶2）萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发除去乙酸乙酯，浓缩液经真空干燥制得紫苏提取物样品。1.3.2紫苏提取物中迷迭香酸的定性—HPLC法[8]所用色谱柱为VP—ODS（150×4mm），检测波长为280nm，流动相为水（含0.1%H3PO4）：乙腈（60：40，v/v），流速为0.5mL/min。精确称取迷迭香酸(RosA)标准品2.5mg，用无水乙醇溶解后定容至25mL，分别进样，测得标准品和提取物的保留时间，比较二者的异同。1.3.3紫苏提取物中迷迭香酸的定量一硫酸亚铁比色法[8]取1.000克紫苏提取物样品，用50ml水加热溶解，离心除去非极性物质，然后取上清液定容至100mL，取0.10mL加入4.87mL0.1mol/L醋酸钠溶液（NaAC，pH6.0），溶解，再加入新配的硫酸亚铁溶液（FeSO4，0.2mol/L）30μL，暗处反应60min，以下不加FeSO4而加30μL水的上述溶液为对照,于572nm比色,测得吸光度A,根据公式A=ε.C.L(C为样品浓度,mol/L；L为比色皿厚度,cm及ε=3.82×103L.mol-1·cm-1),计算迷迭香酸含量m(%质量比)=360.0×C×1/200(迷迭香酸的摩尔质量为360.0g/mol)。1.3.4还原力的测定[9][10]取2.5mL样品于试管中,依次加入2.5mL2.5mol/L磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline,PBS,PH6.6)和2.5mL1%六氰合铁酸钾溶液(K3Fe(CN)6),于50℃水浴20min，后快速冷却,再加入2.5mL10%三氯醋酸溶液(TCA)，以3000r/min的转速离心10min,取上清液2.5mL,依次加入2.5mL蒸馏水，0.5mL0.1%三氯化铁溶液(FeCl3)，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定其吸光度值(以蒸馏水代替样品的混合液作参比溶液)，吸光度值越高还原力越强。1.3.5抗脂质体过氧化活性的测定[5][6][11](1)试液的配制：脂质体PBS分散系（LLS）：300mg卵磷脂溶解于30mL10mmol/LpH7.4PBS，冰浴震荡。三氯醋酸（TCA）-硫代巴比妥酸（TBA）-盐酸（HCI）混合液：15gTCA，0.375gTBA，2.1mL浓盐酸依序放入100mL水中。(2)测定步骤：于样品管中依次加入1.0mL卵磷脂溶液（LIS）、1.0mL400μmol/L三氯化铁溶液(FeCI3)、1.0ml400μmol/L抗坏血酸和1.0mL样品，混匀，避光，于37℃水浴60min，再加入2.0mLTCA—TBA—HCI混合液，90-100℃水浴15min，迅速冷却，以2000r/min转速离心10min，取上清液在535nm测吸光值As。空白管以1.0mL重蒸水代替1.0mL样品，操作方法同样品管，可测得空白管的吸光度Ac。(3)数据处理：抑制率IC（%）=ACASAC×1001.3.6对脱氧核糖氧化损伤的影响[6]取不同质量的样品溶解并取1.0mL，与下列反应试液各1.0mL，三氧化铁溶解（FeCl3，400µmol/L）、EDTA（400µmol/L）、KH2PO4-KOH缓冲液（20mmol/L，pH7.4）、H2O2（3mmol/L）、2，-脱氧核糖（2，-deoxyribose，6mmol/L）与抗坏血酸（ascorbicacid,400µmol/L）,混合均匀。将此试液于37℃培养1h，加入2.0mLTCA-TBA-HCI（15gTCA，0.375gTBA及2.1mLHCI，依序放入100mL甲醇中），于90-100℃水浴中反应15min，冷却后测其532nm处吸光值，记为As。空白管以1mL重蒸水代第3页共6页替1mL样品，操作方法同样品管，可测得空白管的吸光度Ac。数据处理：抑制率IC（%）=ACASAC×1002结果与讨论2.1紫苏提取物中迷迭香酸的定性本文采用HPLC配合光电二极管阵列检测器（检测波长280nm），检测在制备的紫苏提取物中是否含有迷迭香酸。在相同的柱条件下，迷迭香酸标准品和紫苏提取物的保留时间见图1。由HPLC图谱图1可知,紫苏提取物的保留时间7.648min处的峰与迷迭香酸HPLC图谱中峰保留时间7.723min极为相近，可判断为同一物质（迷迭香酸标准图谱中5.0min处的峰为乙醇溶剂峰）。2.2硫酸亚铁比色法确定紫苏提取物中迷迭香酸的含量由于HPLC法对设备的要求较高，日常测量不便，在以下的抗氧化实验中采用了简便易行的硫酸亚铁比色法确定紫苏提取物中迷迭香酸的含量。经测定，按照1.3.1方法制备的紫苏提取物中迷迭香酸含量为37.49±0.24%(质量比)。2.3紫苏提取物的还原力还原力的测定，是检验样品是否为一良好的电子供应者（electrondonors）。还原力强的样品应为良好的电子供应者，其供应的电子除了可使Fe3+还原为Fe2+第4页共6页外，也可与自由基反应，使自由基成为更为稳定的物质[9][10]。依1.3.4的方法测得的紫苏提取物下抗坏血酸的还原力如图2。由图2可知，在本实验所测定的浓度范围内，紫苏提取物与抗坏血酸的还原力均随其浓度的增大而增大，但抗坏血酸的变化趋势强于紫苏提取物。2.4紫苏提取物抑制脂质过氧化的作用卵磷脂中的C-2位上所含的VLDL和LDL中含有的PUFA，在铁离子（Fe2+）的催化作用下，经振荡能诱发过氧化，由此可以建立以铁离子诱发卵磷脂C-2位上的极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）、过不饱和脂肪酸的氧化模型，用以评价样品的抗氧化活性[6]。本文采用了抗坏血酸作为标准抗氧化剂对照，比较紫苏提取物和抗坏血酸在Fe2+引发的脂质体过氧化体系中抑制TBARB（TBAreactionsubstance）生成的作用，结果见图3。由图3可知，在本实验所测定的浓度范围内，紫苏提取物与抗坏血酸对由Fe2+引发的卵磷脂分散系过氧化的抑制能力均随其浓度的增大而增大，且紫苏提取物的变化趋势强于抗坏血酸。由于脂质过氧化在自由基生物学、流行病学上的重要意义，已经建立了很多评价抗氧化剂脂质体过氧化的体外实验体系。本文选择了常用的由Fe2+引发的卵磷酸缓冲液分散系，通过检测卵磷脂的氧化产物—过氧化物经分解产生的二级产物丙二醛（MDA）来衡量脂质体的氧化程度。在酸性条件下MDA与硫代巴比妥酸（TBA）缩合成的红色物质TBARS，在532nm的特征吸收值。根据ArtiArora的报道，很多抗氧化剂的抗脂质体氧化机理主要分为两部分，其一是通过供氢与氧化过程中产生的ROS包括氧自由基(如．O2-,．OH)和脂质过氧化产物-脂过氧自由基(ROO.)或脂氧自由基(RO．)结合，终止脂质体氧化的链式反应，达到抑制氧化的作用，其二是与Fe2+的螯合。过渡金属（Fe，Cu，Co等）离子是脂质体过氧化的重要促进剂，其主要作用是促进过氧化脂（ROOH）第5页共6页和脂分子(RH)和分解和氧分子的活化产生自由基，从而生成多种可以进入脂质氧化链式反应，促进反应发生和进行的游离基[12]。由于本文未进行单纯的样品铁离子螯合能力的测定实验，不能确定磁品是否通过这种方式抑制体系过氧化。2.5紫苏提取物对脱氧核糖氧化损伤的作用氧自由基不但可以引发脂质体的过氧化，还可以通过攻击核酸，一方面可直接攻击碱基使其互相结合，或生成过氧化物，造成碱基破坏；另一方面还可以从戊糖部分提取氢（H），会造成DNA主链断裂[13]。本文采用的实验体系是利用fenton反应发生羟自由基，攻击脱氧核糖，评估样品保护脱氧核糖免于发生氧化损伤的作用。由图4可知，在本实验所测定的浓度范围内，紫苏提取物与硫脲的对脱氧核糖氧化损伤的抑制作用均随其浓度的增大而增大，硫脲的变化趋势略强于紫苏提取物。但在本实验体系中，自由基的引发剂为Fe2+/H2O2，所以如果样品具有铁离子螯合能力，可以能过螯合Fe2+，抑制fenton反应的发生，来保护脱氧核糖，而非直接与自由基反应，通过还原自由基来抑制其对脱氧核糖的破坏，对本实验结果产生影响。3结语本文初步研究了紫苏提取物的制备方法、迷迭香酸测定方法以及其在还原力、脂质体和脱氧核糖三个体系中的反应活性，紫苏提取物在三个体系中均表出较强的抗氧化能力。本文尚未分析紫苏提取物中除主要抗氧化物质—迷迭香酸外的其他组分的归属及其抗氧化能力，有待后续实验进一步研究。参考文献1．郑建仙.功能性食品(第二卷)[M].北京:中国轻工业出版社.1999,92．黄炼栋等.迷迭香酸生产的生物技术研究.国外医药.植物药分册[J].1997,12(3)3.邹正午等.迷迭香酸抗血栓和抗血小