4-从基础到临床.

前言•2014年的ADA于6月在美国旧金山召开•加拿大多伦多大学的DanielDrucker教授由于在肠道激素研究领域的突出成就而被授予了今年的Banting大奖“当我怀着忐忑而沮丧的心情进入胰高血糖素研究组时，谁能料到，这个基因将产生比任何其他基因数量更多的治疗药物呢？”-------DanielDrucker今年Banting奖的主要话题GLP-1RA对胰腺β细胞的作用GLP-1RA对心血管的作用DPP-4i对GLP-1和GIP的作用GLP-1RA对中枢和肠道的作用GLP-2对短肠综合症的作用GLP-1RA对胰腺β细胞的作用GLP-1RA对心血管的作用目录GLP-1RA基于病生缺陷的降糖机制探讨GLP-1RA对心血管保护的作用机制探讨对肠道激素的展望2008年Banting奖：糖尿病发病机制从“三英会”到“八重奏”----RalphA.DeFronzoDefronzoRA.Diabetes.2009Apr;58(4):773-95.肠促胰素分泌减少中枢对葡萄糖摄取的抑制反应降低脂解作用增加肾脏葡萄糖重吸收增加胰高糖素生成增加高血糖肝糖输出增加胰岛素分泌减少葡萄糖摄取减少GLP-1具有多重生理作用baggioLL,etal.Gastroenterology.2007;132(6):2131-57.L细胞分泌GLP-1GLP-1葡萄糖输出肝脏胰岛素敏感性肌肉肠道胰岛素分泌和合成α细胞胰高糖素分泌β细胞新生β细胞凋亡胰腺胃胃排空大脑神经保护作用食欲心脏保护作用心脏输出心脏GLP-1和β细胞：远不止简单的促进胰岛素分泌？LiY.etal.JBiolchen.2003Jan3;278(1):471-478对照组EX-4STZSTZ+Ex-4血糖浓度(mM)110Exendin-4(Ex-4)-----------------30天----------------胰岛素(ng/mL)对照组Ex-4STZSTZ+Ex-4*P0.05STZvsSTZ+Ex-4短暂的注射GLP-1RA可以改善STZ-诱导小鼠的葡萄糖内稳态STZ-链脲佐菌素*天STZGLP-1和β细胞：减少小鼠的β细胞凋亡STZEX-4Day1378Glp1r+/+miceEx-4=Exendin-4STZ=链脲佐菌素LiY.etal.JBiolchen.2003Jan3;278(1):471-478凋亡细胞数/胰岛**P0.05GLP-1和β细胞：内源性GLP-1受体信号缺失会影响β细胞的存活STZ=链脲佐菌素对照组STZGLP-1R+/+GLP-1R-/-凋亡细胞数/胰岛LiY.etal.JBiolchen.2003Jan3;278(1):471-478P0.05GLP-1R+/+(STZ)GLP-1R-/-(STZ)GLP-1增加啮齿类动物的胰腺重量-机制探讨KoehlerJ.&Drucker.D.J.未发表胰腺重量胰腺重量(g)胰腺重量(%体重百分比)胰腺重量(%体重百分比)水肿水分含量%(湿重-干重)/(湿重*100）PBSEx-4PBSEx-4PBSEx-4GLP-1增加啮齿类动物的胰腺重量-增加蛋白质合成KoehlerJ.&Drucker.D.J.未发表PBSEx-4PBSEx-4PBSEx-4DNA含量蛋白质含量DNA/蛋白质含量DNA含量(μg/mg组织)蛋白质含量(μg/mg组织)DNA/蛋白质含量(μg/mg组织)小鼠胰腺中哪一种蛋白质会被GLP-1R信号选择性调节？C57BL6雄性小鼠经过Ex-4或生理盐水治疗1周治疗组治疗组对照组对照组KoehlerJ.&Drucker.D.J.未发表通过质谱分析法，较多胰腺特异性蛋白会受到Exendin-4的影响，要么增加，要么减少，要么没有明显改变GLP-1促胰岛素分泌具有葡萄糖浓度依赖性的特点Naucketal.Diabetologia1993;36:741–4均数(标准差);n=10;*p0.05;2型糖尿病患者(n=10)安慰剂人体自身GLP-12403002001000胰岛素(pmol/L)时间(分)-30060120180时间(分)PBO葡萄糖(mmol/L)151050-30060120180240时间(分)胰高糖素(pmol/L)-3006012018020100240****************输注输注输注GLP-1葡萄糖浓度依赖性降低血糖的机制GLUT-2KATPCa2+GLP-1受体葡萄糖浓度↑囊泡储存库囊泡释放库ATPADPGHenquinJ.,Diabetes49:1751–1760,2000利拉鲁肽有效降低糖化血红蛋白达1.6%Marreetal.DiabetMed2009;26;268–78(LEAD-1);Naucketal.DiabetesCare2009;32;84–90(LEAD-2);Garberetal.Lancet2009;373:473–81(LEAD-3);Zinmanetal.DiabetesCare2009;32:1224–30(LEAD-4);Russell-Jonesetal.Diabetologia2009;52:2046–55(LEAD-5);Buseetal.Lancet2009;374:39–47(LEAD-6)全部患者,除†之前接受饮食和运动控制的患者,‡之前接受OAD单药治疗的患者*与对照相比具有显著差异0.0-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0-1.2-1.4联合SULEAD-1‡联合MetLEAD-2‡联合Met+TZDLEAD-4联合Met+SULEAD-5-1.6-1.3*-1.5*-1.5*单药LEAD-3†51%43%-1.4*-1.3-1.2-1.6*-1.2*-1.5*-0.9-1.3-0.8-1.1-0.5基线A1c%8.38.18.68.58.48.78.68.48.38.88.78.58.58.4-1.1*-0.8Met和/或SULEAD-68.28.1利拉鲁肽1.8mg利拉鲁肽1.2mg格列美脲罗格列酮甘精胰岛素安慰剂艾塞那肽HbA1c变化(%)(18-80岁)[平均56±10岁](18-80岁)[平均53±10.9岁](18-80岁)[平均56±10岁](18-80岁)[平均57.5±9.9岁](18-80岁)[平均55±10岁](18-80岁)[平均63.7±10.1岁]利拉鲁肽降糖达标同时低血糖事件非常少LEAD1-6荟萃分析：不同HbA1C水平时的低血糖发生率低Goughetal.Diabetes2010;59(Suppl.1):A208-9(764-P).低血糖事件发生率/患者年654321066.577.58磺脲类(格列美脲)利拉鲁肽1.2mg利拉鲁肽1.8mg治疗26周HbA1c水平(末次观察值结转法)小结Incretin对于糖尿病的发生发展至关重要基础研究证实，GLP-1可以减少β细胞的凋亡并增加胰腺中的蛋白质合成GLP-1增加胰岛素分泌具有葡萄糖浓度依赖性一天一次注射人GLP-1类似物利拉鲁肽，可以显著降低T2DM患者的HbA1c，低血糖事件少目录GLP-1RA基于病生缺陷的降糖机制和功效GLP-1RA对心血管保护的作用机制探讨对肠道激素的展望GLP-1降低内皮细胞的氧化应激反应：显著降低NADPH氧化酶gp91phox与p22phox亚基mRNA的表达ShirakiA,etal.Atherosclerosis.2012;221:375-38237℃5%CO2培养箱中培育人脐静脉内皮细胞,分析利拉鲁肽对TNF-α引起内皮细胞损伤的作用对照组对照组mRNA表达水平mRNA表达水平TNFαTNFα+利拉鲁肽30nMTNFαTNFα+利拉鲁肽30nM*P0.05GLP-1降低内皮细胞的氧化应激反应：减少氧自由基的产生ShirakiA,etal.Atherosclerosis.2012;221:375-38237℃5%CO2培养箱中培育人脐静脉内皮细胞,分析利拉鲁肽对TNF-α引起内皮细胞损伤的作用*P0.05，**P0.01氧自由基产生水平对照组TNFα利拉鲁肽30nMTNFα+利拉鲁肽30nMTNFα+利拉鲁肽300nMTNFα+利拉鲁肽3nMNSGLP-1降低内皮细胞的氧化应激反应：增加超氧化物歧化酶2、过氧化氢酶的水平ShirakiA,etal.Atherosclerosis.2012;221:375-38237℃5%CO2培养箱中培育人脐静脉内皮细胞,分析利拉鲁肽对TNF-α引起内皮细胞损伤的作用超氧化物歧化酶2*P0.05vs对照组过氧化氢酶谷胱甘肽过氧化物酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶2mRNA表达水平对照组利拉鲁肽90minGLP-1减少细胞凋亡，抑制PTX3的表达ShirakiA,etal.Atherosclerosis.2012;221:375-38237℃5%CO2培养箱中培育人脐静脉内皮细胞,分析利拉鲁肽对TNF-α引起内皮细胞损伤的作用*P0.05PTX3：五聚环蛋白3，心脏疾病相关的生物标志物调亡细胞（%）PTX3mRNA表达水平TNFα(+)TNFα+利拉鲁肽30nMTNFα+利拉鲁肽3nMTNFα(-)TNFα(+)TNFα+利拉鲁肽30nM对照组GLP-1保护内皮细胞可能的作用机制ShirakiA,etal.Atherosclerosis.2012;221:375-382利拉鲁肽通过直接改善肿瘤坏死因子-α引起的氧化应激，实现对内皮细胞的保护GLP-1RA利拉鲁肽可以增加MI小鼠的存活率使用利拉鲁肽治疗7天诱导心血管保护基因的表达减少梗死面积和心脏破裂相比安慰剂，改善生存率(80%vs40%,p=0.0001)天数Noyan-AshrafMH,etal.Diabetes.2009Apr;58(4):975-83.生存率(%)生存率PBS利拉鲁肽假手术心输出量假手术PBS利拉鲁肽心输出量(ml/min)ns1612840非糖尿病小鼠**P=0.002GLP-1对心脏的作用：直接vs间接？UssherJR,DruckerDJ.EndocrRev.2012Apr;33(2):187-215.GLP-1对心肌细胞的直接作用？天然GLP-1/GLP-1(9-36)的作用和GLP-1RA有一定的重叠，但也有很多的差异小肠胰腺葡萄糖利用增加心脏功能脂肪酸利用胰岛素分泌胰高血糖素分泌心脏的GLP-1受体主要分布于正常血压或高血压小鼠的心房生理盐水泵AngII泵Glp1r+/+Glp1r-/-HyB:Glp1rPCR:GapdhHyB:Glp1rPCR:GapdhP.CATVNATVNAT=心房VN=心室DruckerDJ,etal.NatMed.2013May;19(5):567-75.GLP-1RA是如何保护心脏的呢？心肌细胞GLP-1受体缺失并不会影响心肌梗塞后的心血管结局LAD:冠状动脉左前降支;LV:左心室;MI:心肌梗塞;LVID:左室內径Ussher.JR,etal.Molecularmetabolism.2014;3:507-517aMHC-CreGlp1rCM-/-假手术（所有的基因型）FI/FIGlp1raMHC-CreGlp1rcm-/-%生存率时间（天）%梗死瘢痕左室梗死壁厚度(mm)LVID(mm)每日Tamoxifen（50mg/kg）持续1周年龄6-8周大小左前降支结扎处死小鼠5周恢复4周Glp1rCM-/-+生理盐水aMHC-Cre利拉鲁肽%左室瘢痕利拉鲁肽通过间接机制改善Glp1rCM-/-小鼠心肌梗塞后的生存率每日Tamoxifen（50mg/kg）持续1周5周恢复1周利拉鲁肽4周年龄6周左前降支结扎处死Glp1rCM-/-+aMHC-CreSLSLS-生理盐水L-利拉鲁肽LV-左心室LAD-冠状动脉左前降支Ussher.JR,etal.Molecularmetabolism.2014;3:507-517Glp1rCM-/-+生理盐水Glp1rCM-/-+利拉鲁肽aMHC-Cre+生理盐水aMHC-