20S人参皂苷Rh2对人结肠癌细胞增殖和周期的影响

20_S_人参皂苷Rh_2对人结肠癌细胞增殖和周期的影响李秋影炎璐璐马晓慧张莉华张兰兰郭治昕（1.天津中医药大学，天津300193；2.天津天士力研究院药理毒理所，天津3004410）摘要：目的研究20（S）-人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao--2和HT-29细胞增殖及周期的影响。方法采用荧光微孔法测定20（s）--人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao-2、HT-29细胞增殖的影响：利用显微镜观察给药后HT-29细胞形态变化：流式细胞术分析20（s）-人参皂苷Rh2对HT-29细胞周期分布的影响。结果20（S）-人参皂苷Rh2对Caco-2、HT-29细胞生长有抑制作用，并呈剂量依赖性：20（S）-人参皂苷Rh2作用48h后，对HT-29、Caco-2细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为19.68、26.79μg/ml；流式细胞分析结果现实，与对照组细胞相比，20（S）-人参皂苷Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例，增加D期细胞比例。结论20（S）-人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞增殖，主要原因是阻滞细胞处于S期关键词：20（S）-人参皂苷Rh2：HT-29：Caco-2：细胞增殖：细胞周期中图分类号：R996文献标识码：A文章编号：1001-1528（2001）11-1874-05人身为五加科人参属植物人参PanaxginsengC.A.meyer的干燥根，是已有几千年应用历史的名贵中药。现代医学研究表明，人参中包含有机酸、维生素、糖类、无机盐、固醇、寡肽、多糖、挥发油类和人参皂苷等多种成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性。人参皂苷Rh2作为人参中一类主要生物活性成分，在癌症的治疗方面具有较强的活性，其中一人参皂苷-Rg3为主要成分的抗癌新药参一胶囊已作为中药一类新药上市。大量研究表明，人参皂苷Rh2也同样具有较好的抗癌活性，如通过抑制端粒酶活性从而诱导肝癌SMMC-7721细胞分化、通过介导细胞内Caspase一类半肽氨酸蛋白酶进行信号传导进而诱导人黑色素肿瘤细胞A375-S2细胞的增殖并诱导凋亡以及逆转耐药的白血病细胞等。药代动力学研究表明，人参皂苷-Rh2主要在肝、胃肠道分布；并通过线粒体途径包括P53、CASP5等多靶点诱导结肠癌SW480细胞凋亡，国内也有文献初步报道人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞株SW620和LOVO生长。从结构上，人参皂苷Rh2可分为S型和R型的构象，其中20（S）-人参皂苷Rh2单体（20（S）-G-Rh2）是植物中分离的主要构型。但20（S）-G-Rh2单体对人结肠癌细胞Ht-29和Caco-2的影响目前还未见报道。本研究旨在观察20（S）-G-Rh2对人结肠癌Caco-2和Ht-29细胞增殖及对周期的影响，以期为新药研发和临床治疗结肠癌提供理论依据。1材料和仪器20（s）-G-Rh2（天津天士力药物研究院现代中药研究所，纯度为90%）：DMEM培养基（GIBCO-BRL公司）；胎牛血清（G1BCO-BRL公司）；二乙酸荧光素FlouresceinDiacetate,FDA（Sigma）；CellCy-clePhaseDeterminationKit（CaymanChemicalCom-pany）；流失细胞仪FACSCcalibur（BechmanDickson公司）；Caco-2、HT-29细胞由西河医科大学基础医学细胞中心引进，由本实验室传代培养；2方法2.1细胞培养于传代将HT-29和Caco-2细胞至于37℃，饱和湿度5%CO2培养箱中常规培养，均用含10%热灭活胎牛血清，1%的抗生素（青霉素100mg/L和链霉素100mg/;）的DMEM完全培养基。细胞呈单层生长，达80%左右融合时，采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA（1：1）混合消化液（胰酶）消化传代，取生长对数期的细胞用于实验。2.2荧光微孔法监测细胞增殖实验将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞，用胰酶消化，用DMEM完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL。接种于96孔培养板中，每孔接种100μL，于37℃，饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后换液，空白对照组为DMEM培养基，实验组每孔加入50-12.5μg/mL5个浓度的20（2）-G-Rh2（用DMEM培养基配置）处理48h，每个浓度组及对照组君左3个平行孔。48h后吸弃板中培养基，加入100μL含2.5μg/mL二乙酸荧光素的PBS重复洗2变，甩去PBS并吸弃板中剩余的PBS，LeicaDM16000B电动倒置荧光相对显微镜在激发和发射波长分别为488nm和530nm下，测定每孔的荧光强度。根据荧光强度计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，并求算出半数抑制浓度（IC50），实验重复3次。细胞生长抑制率%=（1-给药组荧光强度/对照组荧光强度）×100%2.3显微镜观察细胞形态学变化将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞，用胰酶消化，用完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔2mL细胞悬液细胞悬液种于放置盖玻片的6孔板中，培养细胞爬片生长。培养24h，带细胞在盖玻片上贴壁良好后，加入0.2mL20μg/mL20（S）-G-Rh2处理细胞48h，在倒置显微镜下观察细胞形态变化。2.4流式细胞仪检测细胞周期将对数生长期的HT-29细胞，用胰酶混合消化液消化，用完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL。接种于6孔培养板中，每孔接种2mL，于37℃，饱和湿度为5%CO2培养箱中，每孔接种2mL，于37℃，饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后，换无血清的DMEM培养液同步化24h，加不同浓度的20（S）-G-Rh2处理细胞24h，加不同浓度的20（S）-G-Rh2处理细胞24h后，经胰酶（不加EDTA）消化，Assaybuffer洗2遍，（3000rpm，3min），加入固定液固定2h，上机前离心弃去固定液，加入100mg/LR-Nase和5g/L碘化丙啶（PI）染色剂，染色避光30min，流式细胞仪检测细胞周期变化。2.5统计学处理用SPSS10.0软件完成统计学处理，软件完成统计学处理，实验数据以均数±标准差即（X-±S）表示，组间分析比较采用t检验，P0.05表示差异有统计学意义。3.结果3.120（S）-G-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖的影响二乙酸荧光素（FDA）可透过细胞膜并脱脂释放荧光素积累在活细胞中，激发和发射波长分别为488nm和530nm，常用于检测细胞存活率。本研究采用FDA为荧光指标剂建立了微孔板法进行20（S）-G-Rh2对人结肠癌细胞Caco-2和HT-29的增殖影响研究。结果显示，20-（S）-G-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖具有明显的抑制作用，其抑制作用随药物浓度而增强，呈现较好的剂量依赖性。计算药物对HT-29和Caco-2细胞的半数抑制率（IC50）分别为19.68μg/mL和25.79μg/mL。（结果如表1，图1、2）。3.2显微镜观察细胞形态学变化20μg/mL20（S）-G-Rh2处理48h后的HT-29细胞较空白对照组细胞成群贴壁生长、细胞透亮，折光性好。而给药组细胞之间互相脱离，颜色加深，贴壁细胞数量减少，细胞轮廓消失。（见图3）。3.320（S）-G-Rh2对HT29细胞周期的影响20（S）-G-Rh2处理24h后细胞，用流式细胞仪检测细胞周期各时相细胞数。结果显示;20μg/mL20（S）-Gh2处理24h后HT-29细胞在细胞周期的分布发生娴熟性的变化。对照组G0/G1期、G2/M期、G2/M期、S期细胞比例分别为（76.78±4.0）%、（3.61±2.1）%和（19.60±3.59）%、（0.8±1.21）%及（54.54±2.17）%：给药组20（S）-G-Rh2的G0/G1期和G2/M期细胞比例明显的减少，S期细胞比例升高，与对照组有显著性差异（P0.05），具有统计学意义，（建表2，图4）。4讨论结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，临床主要以手术治疗并术后放疗和化疗为主要治疗手段，但对晚期效果不佳。人参皂苷是人参的主要生物活性成分，人参皂苷单体中G-Rh2具有抑癌活性，并对正常组织毒性甚低。目前体内外实验结果表明：通过对细胞周期的影响，诱导细胞凋亡，从而时间和剂量依赖性的抑制多种多种肿瘤细胞的增殖。但20（S）-人参皂苷Rh2对人结直肠癌细胞Caco-2和HT-29的研究还未见到报道,因此本研究通过体外培养人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞，考察20（S）-G-Rh2对人结肠癌细胞的凋亡及细胞周期的影响做初步的探究。本研究结果表明，20（S）-G-Rh2可抑制人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞生长，且这一变化在实验范围内存在剂量依赖性，其IC50分别为19.68和26.79μg/mL。显微镜下现实：当一定剂量的20（S）-G-Rh2作用48h后的人结肠癌细胞HT-29出现明显的细胞死亡形态。肿瘤的发生是一个多步骤、多因素、多阶段改变的过程，其中细胞周期调控失控被认为是肿瘤发生的重要机制。细胞凋亡可发生在细胞周期的各个时相。采用流式细胞分析技术进行细胞周期研究，结果显示：20（S）-G-Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例，增加S期细胞比例，说明20（S）-G-Rh2可阻滞人结肠癌细胞HT-29于S期。与β-拉帕醌阻滞结肠癌细胞SW480、SE620和DLD-1于S期进而导致凋亡的机制相同。综上所述，20（S）-G-Rh2可抑制人结肠癌Caco-2和HT-29细胞增殖，其抑制作用主要是由于其可阻滞细胞处于S期，S期为DNA辅助器，大量的DNA在此期间解旋复制，暴露活性位点，为化疗药物提供更多的靶点。20（S）-G-Rh2可阻滞结肠癌细胞于S期导致凋亡，可与阻滞细胞于G0/G1或G2/M期的化疗药物联合治疗结肠癌。但其确切的分子机制将有待于进一步探讨，20（S）-人参皂苷-Rh2单体将在临床防止肿瘤方面具有广泛的应用前景。