41蛋白质的测定

（三）蛋白质的测定概述1.蛋白质的组成主要元素组成：蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。蛋白质是生命的物质基础，人体11%-13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味及其营养。一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳3.5%，带鱼18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。2.蛋白质系数但是无论样品来源如何，其含氮量一般都在15%~17%，平均为16%。即1分氮相当于6.25份蛋白质--蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数不同。一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；凯氏定氮法、双缩脲反应、福林-酚试剂法、染料结合反应。一类是利用蛋白质中的特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。紫外测定、酸碱滴定法。蛋白质的测定方法分两大类相关标准GB5009.5-2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定NY/T1678-2008乳与乳制品中蛋白质的测定双缩脲比色法GB/T14489.2-2008粮油检验植物油料粗蛋白质的测定GB/T21732-2008含乳饮料蛋白质的定量测定一、凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。16%N=N×6.25=蛋白质含量乳制品K=6.38（N=15.7%）小麦粉K=5.79（N=17.6%）动物胶K=5.6（N=18.0%）冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品K=6.0（N=16.7%）在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素，所以只能称为粗蛋白的含量。1、原理整个过程分三步：消化,蒸馏和吸收,滴定样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后,再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。（1）消化2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O原理（2）蒸馏消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。(NH4)2SO4+NaOH→NH3↑+Na2SO4+H2O（3）吸收与滴定用2%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO4指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）指示剂红色绿色红色（酸）（碱）（酸）甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂：变色点pH5.1酒红色→绿色吸收滴定原理1加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，温度由原来硫酸沸点的330℃上升到400℃，提高了67℃，所以速度也就加快了。随着消化反应过程，水份逸出，硫酸钾浓度增大，使沸点增加。加速了有机的分解。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。但是硫酸钾浓度不可以太高，否则温度太高，生成的硫酸氢铵会分解放出氨，造成氨的损失。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g样品中K2SO4:H2SO4=7g:12mL2加硫酸铜作为催化剂，还可以做蒸馏时碱性指示剂。消化装置2实验步骤（1）样品消化称取适量样品（N:30~40mg)，移入干燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20mL硫酸，轻轻摇匀后进行消化。先小火消化，待消化液完全炭化、泡沫消失后（呈蓝绿色澄清透明），再继续大火加热0.5h，停火冷却后。空白对照：取与处理样品相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂空白试验。（2）碱化蒸馏组装仪器，向接收瓶内加入硼酸及甲基红-溴甲酚绿混合指示剂并使冷凝管下端插入液面下。向蒸馏烧瓶中加入100mL蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70mL400g/LNaOH，摇匀，溶液呈蓝褐色或产生黑色沉淀。加热蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。（3）滴定用微量酸式滴定管，以0.1mol/L盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。（4）空白试验同时做试剂空白（不加样品）同上操作。实验步骤（5）计算c-----HCl标准溶液的浓度，mol/L;V1---滴定空白消耗标准盐酸溶液量，V2---滴定样品消耗标准盐酸溶液量，m----样品质量，g；0.014--氮的毫克当量数F-----氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。实验步骤%100m014.0)(c21FVV蛋白质含量(1)所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。(2)消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，勿使炭化物质上升到消化管上部。待消化液均匀沸腾后，再加大火力。(3)消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。3注意事项(4)如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失。而硫酸不与氨作用，因此当硫酸过多被底物消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。(5)样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。注意事项(6)—般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。注意事项北京福德泰和科技有限公司产品名称：凯氏定氮仪二、双缩脲法传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法脲（尿素）NH2—CO—NH2加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应（缩二脲反应）。NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH21原理蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）碱性酒石酸钠：10mLKOH(10mol/L)溶液和20mL酒石酸钾钠(25%)加到930mL水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40mL。2试剂（1）标准曲线绘制取蛋白质液0.02.04.08.010.0mL于10mL容量瓶→分别加水定容10mL→加50mL碱性酒石酸钾钠→吸混合液15mL离心到完全透明→取上清液5mL于→10mL容量瓶→加水定容→560nm处测定吸光度→以吸光值和蛋白质含量绘制标准曲线（2）样品测定：→准确称样0.5g于10mL离心管→加50mL碱性酒石酸钾钠→同上，560nm处测定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量。3试验方法双缩脲法对白、红蛋白产生的颜色反应相近，不受温度影响。可快速测定蛋白质含量，但灵敏度低，测定范围为1～20mg蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定，常用于谷物蛋白质含量测定。三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等对本反应有干扰。方法特点及应用范围三、Folin-酚法测定蛋白质含量1.原理：Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)还原，产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物氨基酸（酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸）还原为蓝色化合物（钼兰和钨兰混合物）,在750nm有最大吸收。实验的优点：Folin-酚法广泛应用于水溶性蛋白质含量的测定。Folin-酚法的灵敏度比双缩脲法高100倍，肽键显色效果增强，减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法由于两步呈色反应可以叠加，其灵敏度特别高，所以适于20～250ug微量蛋白质的测定，可检测的最低蛋白质量达5ug。2.试剂Folin-酚试剂试剂甲：（A）称取10gNa2CO3，2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。（B）称取0.5gCuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲。试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠和700mL蒸馏水，25g钼酸钠，再加50mL85％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。3.试验方法(1)标准曲线的制作配制标准牛血清白蛋白溶液：250μg/mL的牛血清白蛋白溶液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,加水定容至1.0mL,配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。→然后各加Folin-酚试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，→再各加0.5mLFolin-酚试剂乙，立即混合均匀，静止30min后。→以不含蛋白质的1号试管为对照，用分光光度计于750nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。(2)样品的提取及测定→准确称取样品1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用6mL蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管.→离心4000r/min、20min。→将上清液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。(3)取普通试管2支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于750nm波长下测定光密度，并记录结果。计算从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（μg），再计算样品中蛋白质的百分含量。蛋白质含量（％）=[X（μg）×稀释倍数]÷(样品重×106)试验注意事项（1）Folin乙试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。（2）Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，不同蛋白质含量不同而使显色强度稍有不同。本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。3）酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇）EDTA和脲素均会干扰反应。但质量分数或体积分数在5％时，尿素、硫酸钠、硝酸钠、三氯乙酸、乙醇、乙醚和丙酮对显色无影响，高浓度时必须作校正曲线。四．紫外吸收法1.原理：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm