42动物细胞与组织培养-干细胞

华侨大学生物工程系刘建福1第4章动物细胞与组织培养－－干细胞华侨大学生物工程系刘建福2胚胎干细胞造血干细胞神经干细胞间充质干细胞华侨大学生物工程系刘建福3干细胞的有关特性一、形态和生化特征•形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例较大•干细胞具有较高的端粒酶活性，具有较强的增殖能力二、增殖•缓慢性－－利于细胞对特定的外界信号作出反应，以决定进行增殖还是进入特定的分化程序。还可减少基因发生突变的可能性。•自稳性－－干细胞自我更新维持自身数目的恒定。这是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。华侨大学生物工程系刘建福4干细胞（stemcell）是一类具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。–根据其发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。–根据其分化潜能的大小，可分为：①全能干细胞。它具有形成完整个体的分化潜能，可以无限制地增殖，能分化成成体的200多种细胞类型，从而可以形成任何组织和器官。胚胎干细胞属于此类。②多能干细胞。它具有分化成多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如间充质干细胞。③定向干细胞。只能向一种或密切相关的细胞类型分化，如造血干细胞和神经干细胞等。三、分化潜能与干细胞的种类华侨大学生物工程系刘建福5干细胞华侨大学生物工程系刘建福6华侨大学生物工程系刘建福7干细胞的分裂华侨大学生物工程系刘建福8正常干细胞发育华侨大学生物工程系刘建福9华侨大学生物工程系刘建福10胚胎干细胞•胚胎干细胞包括ES细胞（embryonicstemcell）和EG细胞（embryonicgermcell）。•ES细胞：当受精卵分裂发育至囊胚期，胚胎细胞在囊胚腔内成团存在，称为内细胞团（innercellmass）。将细胞团的细胞分离出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性。•EG细胞是由原始生殖细胞（primordialgermcell,PGC）培养分离得到。•ES是一种高度分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。•ES细胞可以在体外培养成为永久性细胞系，人们可以在体外对其进行各种遗传操作，通过核移植技术生产转基因动物。华侨大学生物工程系刘建福11胚胎干细胞华侨大学生物工程系刘建福12•胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）是已知的分化潜能最广的一类干细胞。•胚胎干细胞的研究历史可以追溯到1958年，Stevens等将小鼠附植体胚胎异位移植到肾脏的被膜下，得到一种能够连续传代的多潜能细胞系，称为胚胎癌细胞（embryoniccarcinomacell）或畸胎瘤（teratocarcinomacell），简称EC细胞。•胚胎干细胞系建立于1981年。英国剑桥大学的Evans和Kaufman，美国加州大学的Martin分别成功地分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞。此后，一系列其它动物的胚胎干细胞相继分离和建系，如金黄地鼠、大鼠（1988）、猪（1990）、牛（1992）、水貂和兔（1993）等。•1995年Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界上第一株灵长类动物的胚胎干细胞。胚胎干细胞的研究概况华侨大学生物工程系刘建福13•1998年他们在建立灵长类胚胎干细胞取得成功的经验基础上，从接受不孕症治疗的夫妇所捐赠的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出人的ES细胞。同年，Gearhart从选择性流产所得到的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞。•2000年，澳大利亚的Reubinoff和新加坡的体外受精专家合作，又成功地从人胚泡中建立了8株未分化的人胚胎干细胞，并在体外分化实验中成功地得到了神经干细胞。华侨大学生物工程系刘建福14•胚胎干细胞的生物学特征：–a．形态学特征在培养基中，圆形或卵圆形的细胞单层或多层堆积，呈岛状或巢状，细胞界限不清楚；细胞体积小，核大，胞浆少，有一个或多个核仁。–b．发育全能性标志具有发育阶段特异性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigen，SSEA）；碱性磷酸酶（AKP）活性较高；OCT-4基因表达，OCT-4基因是一种发育全能性的标志基因；端粒酶活性很高。华侨大学生物工程系刘建福15胚胎干细胞的生物学特性（P142－143）1ES细胞形态结构与核型2ES细胞的生长特性3ES细胞的高度分化潜能华侨大学生物工程系刘建福16ES细胞的全能性表现：1形成畸胚瘤，将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胚瘤，包括三个胚层细胞。2形成类胚体，将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，能够生成类胚体，是一个与畸胚瘤相似的多种系混杂的集合体，具有三个胚层组织。3直系分化，通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞。如NeuroD2和NeuroD3转入ES细胞可分化为神经细胞。4形成嵌合体，将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体。华侨大学生物工程系刘建福17ES细胞的调控•ES细胞的调控是指给出适当的因子条件，对ES细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。•一内源性调控•1细胞内蛋白对ES细胞分裂的调控•ES细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称性是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分，对细胞的发育非常重要。•2转录因子的调控•脊椎动物中转录因子对干细胞分化的调节非常重要。胚胎干细胞的发生中，转录因子OCT4是必需的。OCT4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同属间的转录调控是不完全一致的。华侨大学生物工程系刘建福18二、外源性调控1分泌因子间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖、分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，即TGFβ家族和Wnt信号通路，如TGF家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。Wnt的作用机制是通过阻止β-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录，促进干细胞的分化。2膜蛋白介导的细胞间的相互作用有些信号是通过细胞－细胞的直接接触起作用的。β-Catenin就是一种介导细胞黏附连接的结构成分。穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响。3整合素与细胞外基质整合素家族是介导干细胞与细胞外基质黏附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。如β1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。华侨大学生物工程系刘建福19ES细胞的鉴定1形态学检测体外培养的ES细胞细胞形态为圆形或扁圆形，均呈单层或多层密集堆积而形成岛状、巢状群体生长状态。2碱性磷酸酶（AKP）活性的检测碱性磷酸酶在早期胚胎的干细胞中含量较高，而在已分化的细胞中活性明显降低。3ES细胞表面可以检测到特异性表面抗原（SSEA-1）,SSEA-1常作为ES细胞鉴定的一个标志。4体内分化实验将ES细胞悬液化注射给同种动物皮下，制作切片染色可观察到畸胎瘤的形成。华侨大学生物工程系刘建福205体外分化实验将ES细胞悬液培养形成囊状简单胚体或类胚体这类细胞多为自发分化，随培养条件和细胞密度而有所不同。6核型分析主要是检测已建立的ES细胞是否具有二倍体正常的核型，可用核型分析加以检验。7OCT活性检测OCT基因是小鼠胚胎发育早期生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞特异性表达的一种发育全能性的标志基因。用OCT抗血清和间接免疫荧光法可检测ES和EG细胞中OCT基因的表达产物。华侨大学生物工程系刘建福21胚胎干细胞的获得•胚胎干细胞的来源为早期胚胎内生细胞团或原始生殖细胞。•哺乳动物早期胚胎的发育属于调整型，每个胚胎细胞都具有全能性。•由胚胎细胞建立ES细胞系的原理就是将囊胚期的内细胞团或桑椹胚在体外培养，并设法阻止其分化。1从早期胚胎的获得2从原始生殖细胞中获取华侨大学生物工程系刘建福22华侨大学生物工程系刘建福23胚胎干细胞的建系过程1ES细胞的分离获得2ES细胞的分化抑制培养抑制细胞分化的手段采用饲养层抑制物使用条件培养基3ES细胞系的建立及保存华侨大学生物工程系刘建福24胚胎干细胞的体外培养1饲养层培养法2无饲养层培养法华侨大学生物工程系刘建福25胚胎干细胞的体外诱导分化1体外ES细胞诱导分化的优点2ES细胞体外诱导分化的基本原理3ES细胞体外诱导分化的方法华侨大学生物工程系刘建福26干细胞培养过程华侨大学生物工程系刘建福27华侨大学生物工程系刘建福28•胚胎干细胞生物学研究的一个重要领域是运用组织工程和基因工程技术，体外对干细胞进行诱导分化，可识别靶基因，发现新基因，并可进一步改造基因，然后用于体内组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗，为临床应用开拓新途径。这部分研究称为干细胞工程。胚胎干细胞的应用前景华侨大学生物工程系刘建福291动物克隆及人类治疗性克隆ES细胞具有无限传代增殖，且不改变其基因型和表现型的特点，以其作为核供体进行核移植后在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体。华侨大学生物工程系刘建福302在转基因动物中的应用利用ES细胞作为载体，体外定向改造ES细胞，使得基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行。这就容易获得稳定、满意的转基因ES细胞系。华侨大学生物工程系刘建福313制备嵌合体动物利用ES细胞可以获得具有来自两个或多个合子体细胞的个体，即嵌合体（chimera），又叫镶嵌体（mosaic）。嵌合体分种内和种间嵌合体两种。通过转基因技术，将不同来源的重要基因转移、组合到嵌合体中，亦即将理想性状结合进嵌合体，使嵌合体具有多种生物学功能，甚至产生新的生物学功能。华侨大学生物工程系刘建福324、成年个体的干细胞研究成体干细胞研究是干细胞研究中最激动人心的部分。它可以有效地防止组织排斥，可以避免伦理学、法律系方面的争论。1.成体干细胞是否具有胚胎干细胞那样的分化潜力？大量的动物实验证明了成体干细胞具有很强的分化能力。如：Recentexperimentsinmicesuggestthatwhenneuralstemcellswereplacedintothebonemarrow,theyappearedtoproduceavarietyofbloodcelltypes.Studieswithratshaveindicatedthatstemcellsfoundinthebonemarrowwereabletoproducelivercells.下边的几个最新的研究成果进一步说明包括人在内的高等生物的成体干细胞依然有明确的分化能力。华侨大学生物工程系刘建福33从成年小白鼠未发育的脑干细胞转变为肌肉细胞AngeloVescovi和GiulioCossu,在theInstituteforStemCellResearchinMilan2000920他们也用成年人志愿者的神经干细胞实现了同样的工作华侨大学生物工程系刘建福34WithASongInTheirHeads--Birthofnewbraincellsinducedinbirds华侨大学生物工程系刘建福35影响成体干细胞应用的某些因素：A.当前并没有在所有人体组织中发现成体干细胞；B.成体干细胞含量极少，很难分离与纯化；C.对某些病人来说，可能：疾病的进程等不到足量干细胞的培养；病人自身基因组有遗传缺陷；华侨大学生物工程系刘建福36ES细胞研究面临的难题1、体外培养ES细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。2、ES细胞高度未分化，具有形成畸胎瘤的可能性。如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞，是至今仍未解决的问题。3、ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程，很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。4、最大的障碍来自伦理学