生物人工肝研究进展和应用前景

[e-mail]2008918;16(26):2907-2915ISSN1009-3079CN14-1260/REDITORIALResearchprogressandprospectsofbioartificialliversystemYi-TaoDing,Chun-PingJiangYi-TaoDing,Chun-PingJiang,DepartmentofHepatobili-arySurgery,theAffliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool;HepatobiliaryInstituteofNan-jingUniversity;JiangsuProvincialCenterofHepatobiliaryDieases,Nanjing210008,JiangsuProvince,ChinaSupportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina,No.30371391;theKeyProgramsofMinistryofHealth,No.WKJ2005-2-032;andtheKeyProjectFounda-tionofNanjingCity,No.ZKX0410Correspondenceto:Yi-TaoDing,DepartmentofHepa-tobiliarySurgery,theAffliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool;HepatobiliaryInstituteofNanjingUniversity;JiangsuProvincialCenterofHepa-tobiliaryDieases,Nanjing210008,JiangsuProvince,[e-mail]:2008-06-30Revised:2008-08-01Accepted:2008-08-19Publishedonline:2008-09-18AbstractLivertransplantationistheonlyestablishedtreatmentforacuteliverfailure(ALF),oneofthemostchallengingclinicalsyndromes;however,donorshortagesremainproblematic.Artificialliversasabridgetolivertransplantationarebeingconsideredworldwide.Non-bioarticificalliver(NBAL)havelimitationsinimprovingthesurvivalrates.Therefore,abiologicalartificialliver(BAL)thathasmetabolic,detoxic,andsyntheticfunctionofhepatocytesisanticipated.Biologicalartificialliversareclassifiedbycellsource,typesofculturesystemforhepatocytes,andtypesofbioreactor.ThispaperreviewsthebioartificialliverdevicesthathavebeenclinicallytestedtosupportALFpatients.Finally,weidentifyseveralimprovementscriticaltobioartificialliverreplacementtherapyinthefuture.KeyWords:Acuteliverfailure;Bioartificialliver;LiversupportDingYT,JiangCP.Researchprogressandprospectsofbioartificialliversystem.ShijieHuarenXiaohuaZazhi2008;16(26):2907-2915,,,.,、,、.,.人工肝支持系统(artificialliversupportsystem,ALSS)简称人工肝,是20世纪50年代逐渐发展起来的用来为肝衰竭患者提供体外肝脏功能支持的技术方法.经过50余年的发展,目前人工肝治疗技术已逐渐成熟,基本形成3大类:(1)非生物型人工肝(non-bioartificialliver,NBAL):指各种以清除毒素功能为主的装置,如血液透析、血液滤过、全血/血浆灌流、血液置换、分子吸附循环系统等;(2)生物型人工肝(bioartificial®,,,、,,,,.,BAL,..,,、liver,BAL):一般专指人工培养的肝细胞为基础构建的体外生物反应装置;(3)混合生物型人工肝(hybridbioartificialliversupportsystem,HBALSS):由生物及非生物部分共同构成的人工肝支持系统[1].1963年Nose教授等在成功通过血液透析系统治疗肾功能衰竭50年后,首次报道一种替代肝脏合成和代谢功能的装置,该装置含200g猪肝细胞,滤过膜采用肾透析所用的50kDa凝胶纤维素膜,这是生物人工肝早期雏型.1986年Demetrion教授首先提出BAL的概念,即由肝细胞和人工解毒装置共同组成的循环系统,能发挥肝细胞的作用[2].构建BAL三要素为细胞来源、细胞培养方式及生物反应器,这些一直是人们研究的重点,虽取得一些进展,但至今仍存在许多理论和临床实践上迫切需要解决的问题,如昀佳细胞来源、体外细胞长期稳定性、活性的提高和生物反应器重建肝脏的三维结构等,但生物型人工肝作为肝移植过渡支持手段的效果是肯定的,并且对严重肝衰竭患者肝功能自然恢复也起到重要作用,同时在肝移植供体匮乏的当今时代,生物性人工肝有可能成为替代肝脏的一种方法[3-4].本文主要就上述BAL三要素研究进展和应用前景作一述评.肝组织主要由两种类型细胞组成:实质细胞和非实质细胞.肝实质细胞是肝脏主要功能细胞,具有非常复杂的代谢功能,包括代谢、凝血、蛋白合成和解毒.非实质细胞如星状细胞、Kuppfer细胞、内皮细胞、胆管内皮细胞等对维护肝脏的结构和功能极其重要.目前,所有临床实验的BAL都尝试着去模仿肝细胞的功能,从而来实现对患者的治疗作用.这些肝细胞获取方法大多是采用肝细胞外基质释放的胶原蛋白酶经肝脏脉管系统灌注[5].但是,人体肝细胞是表皮细胞源性的,需要细胞与细胞之间的接触以及与非实质细胞的接触才能发挥其生理功能[6].现有BAL装置大多缺乏这一要求即微环境,因此BAL中肝脏细胞多表现为功能降低,关键酶活性丧失以及昀后导致繁殖能力丧失[7].另外,这些BAL系统大多采用常规一层膜培养细胞技术,其模拟代谢转化梯度和矢量与体内相比较差.因此,理想的BAL细胞来源是当前迫切需要解决的问题之一.目前,BAL的细胞来源主要有下列几种.2908ISSN1009-3079CN14-1260/R1.1较理想BAL细胞来源是自体肝细胞.自体肝细胞从分化起源上来讲,有着相同的免疫原性,不会发生免疫排斥反应.但临床上终末期肝病患者其肝细胞胞的数量和质量均不能满足BAL肝细胞的要求,这些病态的肝细胞一旦离开体内微环境会失去他们全部功能.所以人类自体细胞虽然有免疫方面的优势,但不能作为一种满意的细胞来源.同种异体肝细胞是另一个比较好的细胞来源,但异体肝细胞有三方面的因素限制了其使用.一是来源有限,在临床上很难立刻获得足量健康肝细胞;二是同种异体存有免疫排斥;三是从人类组织中提取,可能会传播一些疾病.为了克服上述不足,有作者研究人类肝细胞永生化技术,即建立人类永生化肝细胞株,其原理是通过在细胞中导入含肿瘤基因的病毒/质粒,从而使细胞逃避M1衰老期,再通过诱导端粒酶保持端粒的长度,从而使细胞逃避M2危机期,昀终达到永生化.目前主要使用SV40T和hTRET这两种肿瘤基因.这类细胞来源广,免疫并发症少,但肝功能保留不全,还存在致癌及病毒感染的风险.近年来,有学者研究了一种可恢复性肝细胞株,他是在将肿瘤基因导入原代细胞获得永生化后,再以特异性位点重组技术切除该基因,使细胞恢复到永生化前的状态,从而避免了其致癌性及病毒感染,但该技术仍处于基础研究阶段,有望使同种异体肝细胞作为BAL的昀好的细胞来源[8].1.2在体外,具有无限生长潜能的肝细胞株被证实是BAL一个有希望的细胞来源.这些细胞大多是从人类肝脏肿瘤细胞分化而来,而且在体外培养时显示出了很好的耐受性.昀常用于BAL研究的细胞株是HepG2-C3A细胞株.选择这一细胞株的原因是他具有正常细胞的大多数功能,包括白蛋白的合成,P450活性和尿素的代谢,由于他是肿瘤源性的,可产生AFP,作为HepG2功能的一个标志.由于这些细胞是从恶性肿瘤分离而得到的,有可能转移到免疫妥协的患者身上[9].因此,采用这些细胞作为细胞来源的BAL,常需要一个滤过系统来阻止细胞离开生物反应器.肿瘤源性肝细胞包括C3A、HepG2等细胞株,来源充足,增殖能力强,且具有良好的合成功能[10],但目前只有C3A有应用于临床的报道,这可能是由于其代谢解毒功能较弱,并存在潜在的致癌性所致.目前一个研究方向就是对这类细胞株进行改良,增加其代谢功能,如Enosawaetal用谷氨酰胺合成酶基因转染HepG2细胞,转染后的细胞(GS-HepG2)具有良好的氨清除能力.但是这些系统在临床上广泛使用之前需要更多的临床试验.1.3由于人肝细胞的短缺,很多异种动物肝细胞成为BAL的细胞来源,包括猪、犬、兔、鼠等哺乳动物.异种肝细胞是从其他物种肝脏分离出来的.使用这些细胞的优势在于他们有足够多的数量,而且他们的生产可以被严密的控制.其中,猪肝细胞非常有吸引力,因为他们显示出了诸如尿素合成,白蛋白合成以及P450活性等功能与人类肝细胞相似.这些细胞可以耐受大部分的操作步骤来变得容易获得和储存几个月以备使用.故目前应用较多,很多进入临床的BAL应用的就是猪肝细胞.异种细胞的使用需要关注的是动物源性传染病传播,特别是猪内源性逆转录病毒.在20世纪90年代中期,来自英国的两篇报道提出了关于动物传染性疾病在体外传播,结果导致了欧洲异种肝细胞的临床使用完全被禁止.而在美国,异种细胞的使用法律法规要求进行预筛选,没有动物性传染病的优先使用,而且需长期监视异种细胞植入后的患者.但他也存在着缺点,比如猪逆转录病毒(PERV)的感染问题,虽然目前临床应用的人工肝还没有发现1例感染该病毒,这可能与人血浆中的补体通过经典途径灭活PERV以及异源性抗Gal-a-1,3Gal抗体可以在体外阻止PERV感染人等有关[11-12].但动物试验证实培养液中还是能检测到该病毒的存在,2003年SARS的流行引起人们对人兽共患疾病更加关注.另外异种肝细胞还能出现免疫排斥反应,而且其生物合成功能也不能完全代替人肝细胞,上述因素大大限制了猪肝细胞在BAL中的应用.因此,随着其他组细胞来源关键性技术的突破可能会逐步淘汰异种细胞来源的使用.1.4干细胞是另一类很有希望的BAL细胞来源,在去分化状态下无限增值,而且具有良好的分化能力,多种起源的干细胞在组织动员方面显示有一定的前景,特别是在BAL,包括胚胎干细胞、祖细胞、造血干细胞、骨髓干细胞以及转分化干细胞.但是,这些细胞还没有正式用于BAL.而且应用于BAL的干细胞还处于未成熟阶段.其存在的问题是还没有一种完全有效的纯化和鉴别干细胞的方法