4光合作用

类囊体膜制备及光合电子传递活性分析实验目的掌握叶绿体和类囊体膜的制备方法了解氧极谱法分析光合电子传递活性的原理，掌握光系统不同组分活性的分析方法光合作用仪器分析方法的基本原理及其应用调制式叶绿素荧光仪溶解氧分析仪实验原理光合作用光反应：水的光解与光合电子传递暗反应：C同化影响光反应的因素（内因）放氧复合体PSIIPSI……*PSIIPSIIPSI*PSIH2OO2PheoQAQBPQCytb6fPCFeSFdNADP+还原酶NADP+NADPH2e2e光合电子传递链（Z-scheme）放氧复合体2eO2-.O2H2O2H2O+O2假环式电子传递*PSPS2.光合作用饱和光强1.电子供给饱和3.电子接收能力不限4.合适的监测指标光系统电子传递能力（最大活性）检测基本原理*PSIIPSIIPSI*PSIH2OO2PheoQAQBPQCytb6fPCFeSFdDCMUDCIPMVO2NADP+还原酶NADP+NADPH2e2e光合电子传递链（Z-scheme）放氧复合体2e*PSIIPSII2eFe3+DCIP+……希尔反应（Hillreaction）离体叶绿体在光照条件下照光，使水分解，释放氧气并还原电子受体的反应H2OO2放氧复合体2e希尔氧化剂。完整叶绿体是双层膜结构，如果使用希尔氧化剂不能自由通过叶绿体膜则不发生希尔反应，但裸露的类囊体膜可以。这个性质可用于检测实验提取得到叶绿体的完整度。DCIP（也称DCPIP）的作用希尔氧化剂蓝色，被还原后无色可用于比色测定可接收PSII传递来的电子被还原；也可以被抗坏血酸等还原剂还原，还原后可作为PSI的电子供体DCMU的作用阻断PQ与光系统II的结合位点可逆结合阻断电子从PSII到PSI（实际上是PC）的传递叠氮化钠的作用抑制放氧复合体的释放氧气，但电子传递仍能正常进行3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylureaMV（甲基紫精、百草枯）的作用在PSI后接收电子获得的电子很容易传递给O2，产生超氧阴离子自由基常用作氧化胁迫（oxidativestress）试剂仪器与试剂仪器低温离心机溶解氧测定仪试剂HEPESNaClNaOHNH4Cl蔗糖氯化镁抗坏血酸（钠盐，还原型）叠氮化钠MV（甲基紫精，MethylViologen）DCMU（敌草隆）DCIP（2,6-2二氯酚靛酚，2,6-二氯靛酚钠）试剂配制叶绿体提取液/悬浮液（Hepes-NaOH,pH7.6），1L20mMHepes0.5M蔗糖10mMNaCl,用NaOH调节pH值到7.6，冷却到4℃备用调pH的NaOH统一配置为200mM1全链（PSI+PSII）反应液，200mL50mMHepes10mMNaCl2mMNH4Cl3mMMgCl21.0mM叠氮化钠（有毒，注意）用NaOH调节pH值到7.50.5mMMV（剧毒，最后加，MW=256）PSI反应液：取全链反应液100mL添加以下物质1mM还原型抗坏血酸（易氧化，不能长时间存放）10μMDCMU100μMDCIP23PSII反应液（Hepes-NaOH,pH7.0），100mL50mMHepes10mMNaCl2mMMgCl230μMDCIP用NaOH调节pH值到7.04实验步骤叶绿体提取取菠菜叶片10g，用30ml（10+20ml）提取缓冲液于冰上研磨匀浆匀浆用三层纱布过滤，滤液转到50ml离心管500g，4℃离心5min，取上清液到新管中，弃残渣3000g，4℃离心10min，去上清液，沉淀用10ml提取缓冲液悬浮5000g，4℃离心10min，沉淀用3ml提取缓冲液悬浮，4℃水浴保存备用叶绿素含量测定分别取0.2ml叶绿体悬浮液到3个1.5mlEP管中，各加入0.8ml丙酮，震荡混匀（此处稀释了5倍）4℃10000g离心10分钟，将上清液转移到新管中取叶绿素溶液，稀释适当倍数，测定OD663和OD645计算出叶绿体悬浮液中的叶绿素浓度（取平均值）Chl=(8.02×OD663+22.21×OD645)/1000×总稀释倍数叶绿体原液中总叶绿素含量应在1mg/ml以上稀释叶绿体悬浮液到1mg/ml叶绿素随后实验需要约1ml，制备2ml电子传递活性测定（放氧或吸氧）预先将反应液温度平衡到室温温度取0.9ml反应液到反应杯中，加入0.1ml叶绿体悬浮液（反应体系含100μg叶绿素），插入氧电极，平衡稳定2-3分钟注意电极与反应液间不能留有气泡！开启光源，每隔10秒记录一次氧浓度，共10~20次全链、PSI、PSII活性各重复测定3次数据处理取氧浓度直线变化部分数据，计算氧浓度变化速度用每毫克叶绿素每秒释放或消耗的氧表示光合电子传递速率注意事项叠氮化钠和甲基紫精等实际有毒，注意采取防护措施。操作过程维持低温，尽可能避免直射光氧电极反应杯每次测定前需清洗干净、去除水滴。小心操作避免损坏。透镜聚光焦点处温度较高，反应杯应使用循环水浴；小心操作避免灼伤。实验失败要自行检查原因，然后重做实验思考问题提取液、反应液中各种试剂的作用影响试验结果的因素