4催化反应动力学-3多底物.

酶学彭益强Enzymology国立华侨大学生物工程与技术系第一节单底物反应动力学第二节抑制作用动力学第三节多底物反应动力学第四节别构酶动力学第五节pH和温度对酶催化反应速度的影响主要内容第四章酶催化反应动力学第三节多底物动力学大多数酶促反应是多底物反应,其动力学机理复杂。一、酶促反应分类底物数目酶分类催化反应比例（%）单底物单向单底物假单底物双底物三底物异构酶裂合酶水解酶氧化还原酶基团转移酶连接酶略5122627246大多数酶催化反应是两个或多个底物参与的反应(以双底物反应物系统为例讨论),以转移反应为主,占总酶促反应的50%左右；真正的单底物反应只有异构反应(异构酶催化的反应),只占总酶促反应的5%,将单向的单底物反应(裂合酶反应)计算在内,也不超20%；二、多底物的命名、表示方法以双底物双产物例:（1）底物按与酶结合次序分A、B、C、D；（2）产物按脱离次序分P、Q、R、S；（3）抑制剂I；（4）中间产物分稳态和过渡态（非/中心过渡态）；稳态:酶与底物共价结合,可与另一底物发生双分子反应;过渡态:(1)酶活中心未完全占据;(2)酶活中心已完全占据.（5）稳态中间物用E、F、G表示，过渡态用EA、EB、EAB表示，通常只假定存在着一种中心过渡态中间物（EAEP）表示其异构化（一）Cleland命名和表示方法Cleland命名和表示方法（6）单（Uni),双（Bi),三（Tri),四（Quad)等表示如，BiBi:双底物双产物；UniBi:单底物双产物。按反应动力学分：有序：指所有底物与酶结合必须在任何产物释放之前！（1）序列有序：酶与底物结合严格按一定顺序进行；（2）序列随机：底物与酶结合顺序随意；乒乓：一部分底物与酶结合后即释放一部分产物再结合另一部分底物再释放一部分产物！（7）酶促反应历程用直线表示（除随机）（8）随机机制用菱形表示；（9）Km表示米氏常数，Ki表示抑制常数。（二）多底物反应动力学分类本节主要讨论BiBi反应；按反应方式历程(是否形成三元络合物)分为两大类:（序列与乒乓）1、形成三元络合物（1）序列有序机制（2）序列随机机制底物与酶结合有一定严格顺序，先A后B,产物释放也有同样规定次序，先P（B产物）后Q（A产物）.以NAD+、NADP+为辅酶的脱氢酶为此类机制；例：NAD++CH3CH2OHCH3CHO+NADH+H+（A）（B）（P）（Q）（1）序列有序反应cleland表示法说明（1）中心过渡态EAB可转变为EPQ，也可直接分解为产物，或此中间物有一系列推导出的方程一样；（2）若酶本身发生异构化，则为异型序列BiBi，推导出的方程与（1）有所不同;（3）特殊序列有序机制：EAB形成很慢分解极快在动力学上可忽略。为Theorell-Chance机制EEEAEQABPQ（2）序列随机机制底物与酶结合的先后是随机的，产物释放也是随机的。少数脱氢酶和一些转磷酸基团的激酶属于这一类。如肌酸激酶反应,Cleland表示法肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP(A)(B)(P)(Q)2、反应过程不形成三元络合物即乒乓机制；双置换反应(double-displacementreactions)；特征:酶E与底物A生成复合体，产物P的脱离在另一底物B加入之前。E+AEAEPFEQE+QFBPB乒乓机制图解A和Q竞争自由酶E形式,B和P竞争修饰酶E’即属于乒乓机制的酶大多数是具有辅酶的，如转氨酶等(催化从氨基酸转移氨基到酮酸)，一些糖苷转移酶也是；如转氨酶先与氨基酸（A）作用产生EA释放酮酸（产物P），期间辅酶结构转变酶E变成酶F，F再与底物B（另一酮酸）作用释放产物（相应氨基酸）三、双底物反应恒态动力学对特定反应历程要得到其稳态动力学一般步骤:(1)写出反应历程的方程式(2)再写出包含各种酶形式的微分方程,建立稳态后各种酶存在的形式浓度变化可做等于0(3)根据质量守恒条件去寻找各种酶存在形式的浓度代数解,最终得到酶促反应的速度方程1956年King和Altman在矩阵理论基础上提出了一个简便方法后经Wong和Hanes加以规则化1、King-Altman方法推导速度方程King-Altman方法大体步骤(1)写出反应历程,安排成封闭的几何图形图1式1的K-A图式1(2)写出n-1线的所有可能的图形n代表角数(即酶的存在形式!),m为完整图形的线数,则它的n-1线图形总数为图2：图1的n-1线图形封闭圈问题！当反应历程构成的基本图形不止一个封闭圈时,在写n-1线图时,应把含有封团圈的图形扣除!(3)按K-A图形写出各种酶存在的浓度和总酶浓度的比例,基本表达式:争对每种酶形式,按图2表示的n-1线图中3个形式分别写出其形成过程,可得到:[E0]为总酶浓度,有(1)(2)(4)可方便写出速度方程(3)将(1)、（2）式代入（3）可得式，简化之得这个方程式和用数学法推导出的单底物单产物速度方程形式相同。两例中酶的形式数不同，结果相同，这是因为反应历程中EAEP为中心复合物。图解法推导时中心复合物是可以当作一个酶形式来处理的，虽然此处它们被当作两个酶形式来处理的，但导出的公式和做为一个酶形式来处理是完全相同的。说明:初速度方程所得到的速度方程的一般形式及初速度方程和以前数学推导的结果完全相同。2.Alberty表达式许多双底物酶促反应在固原定一个底物浓度而改变另一个底物浓度时服从米氏方程式；对许多双底物酶促反应，在总酶浓度固定并远小于两个底物浓度时，Alberty根据K-A图形法推导出其方程一般形式为：goback讨论1、[B0]浓度很高时，简化为：与米氏方程一样！水解酶类的酶促反应就如此；2、[B0]固定但未饱和:这也是米氏方程一种形式！3、序列有序机制时,混合常数为KASKBm,非KAmKBm;4、序列随机机制中则都适用;5、乒乓机制初速度内P极低,逆过程忽略,KAS=0,简化为:双倒数图讨论由上分析,当固定一底物浓度改变另一底物浓度时遵守米氏方程;相应双倒数图为线性,分酶完全饱和和半饱和。1/[A0]1/v0斜率=KAm/vmax1/vmax1/[A0]1/v0斜率=(KAm+KAsKBm/[B0])/vmax(1+KBm/B0)/vmax[B0]饱和时1/v0~1/[A0]B0固定≈KBm时1/v0~1/[A0](b)(a)[A0]固定或饱和亦然！附1：Alberty方程系数求解（不饱和）用二次作图法！1、先双倒数作图：1/v~1/[A0],此时固定不同的[B0]例：甘油脱氢酶催化甘油的反应是依赖NAD+的有序BiBi反应：1/v1/[A0][B0]NAD++GlyNADH+DHAGDHAB2、再分别以截矩对1/[B0]作图：1/[B0]1/[B0]~1/[B0]其二次作图的竖轴截矩为1/Vm，斜率为KmB/Vm，横轴截矩为KmB1/VmKmB/Vm以斜率对1/[B0]作图：亦然！！！KmB附2：稳态法推导多底物反应方程例用稳态法推导，可获得稳态法方程:①序列机制的底物动力学的推导序列随机机制稳态推导kA[E][A]=k-A[EA]k1A[EB][A]=k-1A[EBA]k1B[EA][B]=k-1B[EBA]设[E0]=[E]+[EA]+[EB]+[EAB]V=k[EAB]Vm=k[E0]各项代入约去[EAB]，上下同乘[A][B]（I）与Alberty表达式完全相同!酶对底物A的米氏常数(B饱和时)酶对底物B的米氏常数(A饱和时)[A][B]都达饱和时最大反应速度为底物A与E结合的解离常数当则得式（II），与米氏方程相同:Vm（II）（I）②乒乓机制推导由于产物P浓度极低,逆过程可忽略,式（I）中KsA=0故其速度方程为:3.Dalziel表达式Dalziel关于双底物的一般表达式：动力学系数Φ求解①一次作图原方程变换如下式：固定不同[B0]，作[E0]/v0~1/[A0]得一系列直线：[B0]1/[A0][E0]/v0斜率②再二次作图：分别用一次作图截矩、一次作图斜率对1/[B0]作图：1/[B0]一次作图截矩截矩=Ф0斜率=ФB1/[B0]一次作图斜率截矩=ΦA斜率=ΦAB实例甲醛脱氢酶FADH催化甲酸转化为甲醛.此反应为双底物酶促反应,式中Ф为动力学系数;[E0]为酶浓度;[A0]、[B0]为底物A、B浓度.将方程写成以下形式根据Dalziel提出的双底物酶促反应动力学方程式,采用两步法作图即可求得反应过程的动力学常数.截距Y1,斜率Y2AB先固定B(甲酸)的浓度,以[E0]/V~1/[A]作图,得到截距Y1和斜率Y2;在不同B的浓度下可得到不同的Y1和Y2(图1A;再以Y1~1/[B]和Y2~1/[B]进行二次作图(图1B),即可求得Ф0,ФA,ФB,ФAB。图1A37℃,pH7.0下游离甲醛脱氢酶酶促反应图图1B图1A截距Y1～1/[HCOOH]、斜率Y2～1/[HCOOH]关系图最后通过Dalziel方程和Alberty方程之间的常数转换关系求得反应的米氏常数.Dalziel与Alberty比较比较两方程双倒数形式,有:vmax=[E0]/Ф,得:[E0]=vmaxФ,将其代入Dalziel方程双倒数形式中可得：再与Alberty双倒数方程比较有：KAm=ФA/ФKBm=ФB/Ф,KAs=ФAB/ФB1,Dalziel方程可转化为Alberty方程，并可求得相应常数之间关系:2,Dalziel表达式比Alberty表达式中常数形式更直观Dalziel形式（4-61）Alberty形式（4-62）EEA[P]FEB[Q]k1[A0]k3[B0]k-1k-3k2k4稳态乒乓BiBiKing-Altman图顺序机制的各直线交于纵轴左侧一点，但此法不能区别有序顺序机制和随机顺序机制（1）顺序机制双倒数方程：顺序机制Lineweaver-Burk作图法1、底物动力学作图鉴别四、多底物酶促反应机制的鉴别速度方程倒数乒乓机制是平行线作1/v~1/[A](或1/v~1/[B])的图（2）乒乓机制既可鉴别乒乓机制和顺序机制，还可区分顺序机制中的有序和随机机制；例1：反应初期产物抑制Cleland规则(除随机机制外)：规则1：变化底物与一种形式酶结合，产物与另一种形式酶结合，双倒数图中纵轴截矩变化；规则2：变化底物与产物同结合一种形式酶或产物结合酶与此酶可逆相联，则斜率变化；2、抑制剂法PEEABQEAFPFFBEQ乒乓机制例例2：端点抑制剂指抑制剂本身不是底产物，但可与一种或几种酶形式形成络合物形成死端；其对双倒数图截矩与斜率之影响：1，抑制剂与变化底物结合于不同形式酶，抑制作用不可克服，纵轴截矩变化；2，两种情况,斜率变化：（1）抑制剂与变化底物结合相同形式酶;（2）变化底物在抑制剂后，两结合点关联.上述情况可对照书上表4-5,4-6进行理解!反应机制判断例:所以:过程:习题课1、抑制动力学相关；2、双底物反应（Dalzil表达式）