4基因工程载体.

第四章基因工程载体vectors在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。1.载体（Vectors）（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。2.基因工程对载体的要求外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。（5）容易从宿主细胞中分离纯化。基因工程中常用的载体有5类：3.载体的种类质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）第一节质粒载体一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌的质粒（1）分子小：1.质粒的一般生物学特性1—200kb（2）编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。（3）环形状：双链环状DNA。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。（4）质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA③线形DNA（linear，lDNA）一条链上有一至数个缺口。②开环DNA（opencircular，ocDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒:非接合型质粒能自我转移不能自我转移除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。又叫自我转移型质粒。1.接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。大肠杆菌接合（conjunction）2.非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。符合基因工程的安全要求。带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。（2）Col质粒：大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。三、质粒的复制类型1.严紧型质粒（stringentplasmid）拷贝数少，只有1—3份拷贝。2.松弛型质粒（relaxedplasmid）拷贝数多，有10—60份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（1）分子量大，拷贝数低四、质粒载体的构建1.天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。（2）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞…….colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。ColE1（1）具有复制起点（ORI）2.质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）3.质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记①抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：10常用抗菌素的抗性工作原理i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。a）抑菌原理b）细菌抗性原理Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。b）细菌抗性原理Cmlr编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。a）抑菌原理a）杀菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。b）细菌抗性原理Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。iv）链霉素（Streptomycin，Str）a）杀菌原理通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。b）细菌抗性原理Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。v）四环素（Tetracycline，Tet）b）细菌抗性原理a）抑菌原理通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。②遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（2）抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素4.人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体但有特殊用途:由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、pHSG415等不适合大量扩增DNA用。（3）失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。温度低（低于37oC），拷贝数很少；温度增加（40oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。如pBEU1、pBEU2。runawayplasmidvectors1979年B.E.Uhlin等构建。（4）插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性外源DNA无抗菌素抗性（5）正选择的质粒载体如pUR2、pTR262等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。Directselectionvectors（6）表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。1）普通载体元件①表达载体的结构五、经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记四环素抗性Tetr6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）（4）克隆位点2.ColE1（1）类型天然质粒，属高拷贝型。（2）长度6.3kb。（3）选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！①colicinE1基因的结构ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea+kil基因产物③不被其他细菌的colicinE1所杀死的原因imm基因EcoRI位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位点ColicinE1外源DNA无Colicin用对外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作选择，操作非常繁杂。对colicinE1敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicinE1的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷ColE1抗colicinE1杀ColE1-仍抗colicinE1不杀ColE1-插入片断ColE1pSP2124质粒的Ampr基因3.pBR322：（1）元件来源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。③高拷贝数②分子小，克隆能力大载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（mob）的作用位点。（6）pBR322的缺点能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。（7）PBR322的改进pBR325：在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。使EcoRI也成为插入失活型位点。②改造EcoRI位点4.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19①复制起点pBR322的ori但其上失去了克隆位点。②Ampr基因（1）元件来源③lacZ的启动子大肠杆菌④lacZ’基因大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。pBR322的Ampr基因（2）长度约2.7kb（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT5’3’EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIAccIHincIIPstISphIHindⅢpUC18lacZ’AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCGGGGTACCGAGCTCGAATTC5’3’EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIAccIHincIIPstISphIHindⅢpUC19lacZ’Ampicillin抗性和lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。（4）选择标记蓝白斑选择原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-i