3_第五章_菌种的制备和保藏

第五章菌种的制备和保藏5.1微生物的生长、繁殖5.2固体孢子的制备5.3摇瓶种子的制备5.4菌种保藏第1节微生物的生长、繁殖一、概述生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。单细胞微生物：生长伴随着细胞数目的增加——繁殖霉菌：细胞生长并不一定伴随着个体数目的增加——生长，而非繁殖如菌丝细胞从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程二、细菌的繁殖裂殖是细菌最普遍、最主要的生活方式孢子的产生方式：三、放线菌的繁殖通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可借菌体断裂片段繁殖。1.凝聚分裂形成凝聚孢子2.横膈分裂形成横膈孢子3.孢子囊形成孢囊孢子4.分生孢子5.厚壁孢子放线菌的孢子具有较强的耐干燥能力，但不耐高温，60~65oC处理10~15min即失去生活能力。1）极性生长放线菌的繁殖体以极性伸长方式进行生长通过顶端菌丝的延伸2）分化基内菌丝提供营养物质供气生菌丝生长3）孢子形成4）分枝菌丝分枝一般发生在坚硬细胞壁恢复可塑性时放线菌的生长方式四、霉菌的繁殖方式主要靠形成无性或有性孢子测定群体的增加量——群体生长五、微生物生长的测定测定个体的生长没有实际应用价值。直接法间接法1、直接法又称为全数法a）涂片染色法将定体积的待测液均匀涂布在已知面积的载玻片上，经固定染色后计数b）计数器测定法细菌计数器或血球板计数器c）比浊法简便、快速2、间接法又称为活菌计数法常用平皿菌落计数法——活菌计数六、群体生长规律测定生长曲线第2节固体孢子制备固体孢子是生产种子的一种形式。一般繁殖能力强、孢子数量多的菌种可用固体孢子进罐。孢子进罐的优势：孢子处于半休眠状态，细胞内的代谢活动降到最低点；进种子罐后，所有个体都从同一水平起步生长，获得同步生长或接近同步生长。另外，进罐前若将孢子在水中浸泡数小时有利于孢子快速发芽和同步生长一、不同菌种的固体孢子制备工艺四环素生产用的孢子制备在茄子瓶斜面上生长周期为3~4d，孢子总数50亿以上。1.斜面培养基（%）麸皮3.2(NH4)2HPO40.015MgSO40.005琼脂2.2KH2PO40.01麸皮是主要原料其质量对培养基起决定性的作用采用优质小麦，冲洗后盖湿布使充分均匀的吸水盖闷2~3h后晾干水分，磨成片状后过20目筛晾干备用2.斜面孢子培养35oC恒温培养100h。培养室内空气湿度不低于30%（30~60%）湿度不足菌丝生长缓慢，孢子繁殖数量少湿度过大则菌丝疯长，不利于产孢培养成熟的斜面孢子每瓶加无菌水40~50ml制成孢子悬液利用压差接种至种子罐接种量500亿个孢子/m3。二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法1、孢子质量的影响因素原材料质量培养基配比培养条件（温度、pH湿度、通气量）孢子发育阶段孢子数量等2、固体孢子培养的最佳阶段固体孢子的生长繁殖可划分为三个生理阶段：营养菌丝繁殖气生菌丝繁殖分生孢子繁殖繁殖体遗传体以分生孢子进行传代和保存二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法菌种的遗传基因型；培养条件3、培养基组分的影响碳、氮比例无机盐菌丝生长与孢子繁殖的矛盾限制营养和干燥可以促进孢子生长碳、氮过于丰富有利于菌丝的生长不利于孢子繁殖金属离子：Mg、Fe、Cu、Mn、Na以及P促进孢子形成二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法通气量4、通气量的控制抗生素产生菌都是好氧菌通气量均匀一致包括各级种子培养采用质量一致的棉塞（试管、茄瓶、三角瓶等）二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法5、培养温度的控制多数微生物能在24~37oC生长。最适温度：指细胞新陈代谢活动的适宜温度。有些菌的菌丝最适生长温度与生物合成抗生素的最适温度有所差异。可在生产的不同阶段控制不同的培养温度。二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法6、培养室湿度的控制固体孢子培养要求适宜的空气湿度。湿度的变动会影响种子间的差异。另外需要同时考虑接种量和培养基的水分含量比如大米、小米等培养基质的含水量与菌丝生长有关。小米孢子含水量约为1：1；大米孢子含水量在24~27%为宜。二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法第3节摇瓶种子的制备摇瓶种子：从斜面种子接种入锥形瓶内的液体营养培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。1.配制—接种—培养—接种或保存1）菌体浓度（活菌体数）2.摇瓶种子的质量标准2）菌体生长阶段对数生长后期1）培养基组成首先要求菌体生长对所有营养成分的需要，该前提下培养基组成越丰富，所获得的菌体浓度越高3.影响摇瓶种子质量的因素及其控制2）摇瓶装量影响通气效果需要结合产生菌的耗氧特性和摇床的转速3）摇床转速3.影响摇瓶种子质量的因素及其控制4）摇瓶在摇床中的位置4.孢子接入量第4节菌种保藏菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。二、菌种保藏的原理•首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。•其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。•尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法•各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。•低温是保藏菌种的重要因素之一•一般微生物在-30oC时即停止生长•低温处理菌种时要注意对细胞的损伤因为细胞外的培养基比细胞内物质结冰早可加保护剂甘油常用的保藏方法1、定期移植保藏法2、斜面冰箱保藏法4C；3-6个月3、液体石蜡保藏法1年左右4、菌丝速冻甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20C5、沙土保藏法产孢子或芽孢微生物，5~7年6、真空冷冻干燥保藏法任何微生物；一般5年以上7、液氮超低温保藏法-196C；保护剂；保存期长（一）斜面低温保藏法－－常用保藏法•将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。•此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏•此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。•优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。（二）石蜡油封藏法•此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。•此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。•此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。不适合严格厌氧菌（三）沙土管保藏法•一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它的保藏期约1～10年。该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。（四）麸皮保藏法•又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。•此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较多采用。（五）甘油悬液保藏法•此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。•将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。•基因工程菌常采用本法保藏。（六）冷冻真空干燥保藏法•又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。此法适用于各大类微生物。此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。（七）液氮超低温保藏法•简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。•此法适用于各种微生物菌种的保藏。•此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。•此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。（八）宿主保藏法•此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。•植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。•噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。•动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。•在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。•美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。•我国CCCCM采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。