4第四章蛋白质的共价结构

-1-第四章蛋白质的共价结构1.6肽：肽为氨基酸的线性聚合物，蛋白质是由一条或多条多肽链构成。（一）肽和肽键结构肽的命名从N端开始到COOH端，氨基酸残基按顺序从左向右写，-NH2末端在左，-COOH端在右。如Ser-Gly-Phe，称为：丝氨酰甘氨酰苯丙氨酸。一般氨基酸数目12~20的肽为寡肽（小肽）；20的肽为多肽。（二）肽的物理化学性质（1）与氨基酸同，为离子晶格，熔点高，在水溶液中以偶极离子存在。多肽中酰胺的氢不易解离，肽的酸碱性质主要取决于游离末端的α-氨基和α-羧基，以及侧链R基上的可解离基团，如Glu的γ-COOH、Lys的ε-NH2。（2）滴定曲线：也有等电点，为多价离子等电点。以Gly-Glu-Lys-Ala四肽为例：①当pH3.5，末端可解离基团全部质子化，2个+NH3、2个COOH，净电荷+2；②pH3.5-4.5，C-末端COOH解离（pKa=3.7），为2个+NH3、一个COOH、一个COO-，净电荷+1；③pH4.5~7.5，Glu的γ-COOH解离，2个+NH3、2个COO-(pKa=4.6)，为等电点，净电荷为0；④pH7.8~10.2，N末端-+NH3解离（pKa=7.8），一个+NH3、一个NH2、2个COO-、净电荷-1；⑤pH10.2，ε-+NH3解离，2个NH2、2个COO-，净电荷-2。pH在等电点以上（碱性），多肽带负电荷。pH在等电点以下（酸性），多肽带正电荷。（3）化学反应①与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色，为α-NH2反应（注意：伯胺也可使茚三酮显紫色），氨基酸、多肽均有此反应。Pro为仲胺（亚氨基氨基酸），与茚三酮生成黄色物质。茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。②肽键的双缩脲反应：多肽，蛋白质中有肽键，有此反应，氨基酸没有此反应。双缩脲：H2N-CO-NH-CO-NH2。双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物（如双缩脲或二肽以上等多肽）在碱性溶液中能与CuSO4生成紫红色或紫蓝色复合物，可定性或定量测定蛋白质含量，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。（三）活性多肽：动植物体内存在许多具有生理活性的多肽，多肽药物已获得人们的重视。二肽：肌肽β-Ala-His，抗氧化，抗自由基，消炎，调节免疫。甜二肽AspartameAsp-Phe-OCH3，比蔗糖甜200倍。三肽：谷胱甘肽γ-Glu-Cys-Gly，维持红细胞及其蛋白质中Cys的-SH处于还原态。四肽：促胃酸激素。五肽：脑啡肽，内源性吗啡，与吗啡受体结合。蛋氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPheMet。亮氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPheLeu。八肽：α-鹅膏蕈碱，九肽：牛催产素，牛加压素（升高血压），两者只差两个氨基酸，但生理作用极不相同。十肽：短杆菌肽，为抗生素。促黄体生成激素释放因子，为激素。十六肽：内啡肽，有镇痛作用。二十四肽：促皮质素（ACTH），治关节炎，已商品化。二十六肽：蜂素溶血肽，抗关节炎。五十一肽：胰岛素，降血糖。-2-以活性多肽研究为基础的药物研究：血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂（ACEI）的开发是近代高血压治疗史上的重大进展。人体内存在的血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）为十肽，无活性，但在ACE作用下转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）为八肽，具有收缩血管平滑肌作用，使血压升高。ACEDRVYIHPFHL(AngⅠ)DRVYIHPF(AngⅡ)。ACEI可使ACE失活，使AngⅠ不能形成AngⅡ，从而降血压，研究AngⅠ活性部位，作用机理，进而设计并合成ACEI，已开发出二十多种降压药物，如巯甲丙脯酸（Captopril）、依那普利（Enalapril）、赖诺普利（Lisonopril）等。1.7蛋白质一级结构测定：测定蛋白质中共价键连接的全部情况，包括存在的链内、链间的二硫键位置，氨基酸数目、类型和顺序。蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构，而三维结构决定其生物活性和功能。蛋白质中氨基酸顺序是由基因决定的，是联系DNA遗传信息和蛋白质生物功能的桥梁。蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史，具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基酸顺序。如细胞色素C（P182），是一种含血红素的电子转运蛋白，存在于所有真核生物的线粒体中。40多种物种的细胞色素C序列的研究揭示，在细胞色素C中含有的一百多个氨基酸残基，其中有28个位置上的氨基酸残基是相同的（P182图4-16），这些不变残基对于细胞色素C的生物学功能至关重要，由此可根据细胞色素C序列的物种差异建立进化树（P183图4-17）。来自任两个物种的细胞色素C间序列的氨基酸差异数目越多则进化位置相差越远。（一）蛋白质测序样品纯度应97%，测分子量（允许误差10%）。1.蛋白质分子中多肽链的数目：测N-末端和C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋白要用变性剂将亚基拆开。2.每一多肽链氨基酸组成：鉴定N-末端残基和C-末端残基，定出氨基酸序列参考点。3.按专一方式断裂成较小的肽片段：可用酶或化学方法完成，并用多种断裂方法，将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。4.侧各肽段氨基酸序列：常用Edman降解法，用自动序列分析仪。5.测定片段次序：用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。6.确定二硫键位置。（二）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定（1）N-末端分析①二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法：Sanger反应。2、4-二硝基氟苯称为Sanger试剂，与游离末端氨基反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质，再酸性水解生成DNP-氨基酸（黄色），提取分离后可进行鉴定和定量测定。此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。②丹磺酰氯（DNS）法：有荧光，灵敏度高。5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯（DNS），结构式见170。③Eman降解苯异硫氰酸酯(PITC)法：Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的N-端将氨基酸残基一个个切下来，还可用来测定氨基酸序列。PITC与多肽链每反应一次，得到一个PTH-氨基酸和少一个氨基酸残基的肽。PTH(phenylthiohydantoin)：苯乙内酰硫脲。PTH-氨基酸可用TLC或HPLC快速测定，由此发展出氨基酸序列自动分析仪。④氨肽酶法：用外切酶，从N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶，适用于N-末端残基的氨基-3-酸被封闭的肽（如环肽）；N-末端是焦谷氨酸残基时，可使用焦谷氨酸氨肽酶。（2）C-末端分析①肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应，除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。肼进攻肽键而不易与-COOH反应，肼解中Gln、Asn、Cys被破坏。②还原法：用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇，肽水解后可分离、鉴定。③羧肽酶法：专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸，P171图4-7。（三）二硫键断裂：用变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性，分子内部-S-S-露出，并用HSCH2CH2OH处理，则-S-S-变成2个-SH，再用碘乙醇保护-SH不被氧化，P172图4-8。也可用过甲酸氧化，将-S-S-变成2个磺酸基。（四）氨基酸组成分析：可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解（6mol/LHCl），再用碱水解测Trp。测出Asx和Glx，酰胺基总量由水解液中NH4Cl量计算出。P172表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成。（五）多肽链部分裂解成小肽段，分别测序：现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段，需将蛋白质先裂解成较小肽段，分离后测序。（1）酶裂解法：常用的蛋白酶有以下几种（为内切酶）：胰蛋白酶：水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键，如Lys，Arg。糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：肽键羧基端为芳香族氨基酸，如Phe、Trp、或Tyr，以及疏水氨基酸Leu、Met或His。胃蛋白酶：特异性不太强，切点多，肽键羧基端为芳香族和疏水氨基酸。（2）化学裂解法：溴化氰BrCN断裂羧基端为Met的肽键，反应见P175图4-10，生成肽酰高丝氨酸。（六）肽段氨基酸序列测定（1）Edman化学降解法：每反应一次生成一个PTH-AA，层析分离、鉴定，剩下减少一个残基的肽链，又有新N-端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分析，进行几轮反应就能测出几个残基序列。最低样品用量仅5pmol。Edman降解现已有多种改进。如DNS-Edman测序，可提高灵敏度；试剂的改进，用由荧光基团或有色基团标记的PITC可更灵敏。（2）质谱法：电喷射电离（ESI），见P178图4-11。使蛋白质离子解吸进入气相，15肽以下均可用。（七）肽段在多肽链中次序确定用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段，由于切口错位，可由重迭肽（两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段）确定肽段先后次序，从而拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。（八）二硫桥位置的确定用切点多的胃蛋白酶水解肽链，生成比较小的含二硫桥的肽段混合物，将样品点在滤纸中央，在pH6.5进行第一向电泳分离。然后用过甲酸蒸气熏，-S-S-氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸（带负电荷）的肽。将滤纸转900，在完全相同条件下再进行第二向电泳，大多数肽段迁移率未变，位于滤纸对角线上，而含磺酰丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线（向正极向）。将每对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下，进行氨基酸序列分析，推出二硫桥的位置（肽链内或肽链间）。现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的，但仍需氨基酸序列分析配合。