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SRTP论文题目产低温纤维素酶微生物的筛选与鉴定学院食品科学与工程学院专业生物工程姓名辛悦指导教师张卫兵副教授食品科学与工程学院制二〇一五年目录前言................................................................11材料与方法........................................................21.1实验材料.....................................................21.1.1样品....................................................21.1.2培养基..................................................21.1.3主要试剂................................................21.1.4主要仪器................................................21.2实验方法.....................................................31.2.1纤维素酶产生菌的初筛....................................31.2.2纤维素酶产生菌的复筛....................................31.2.3形态学观察..............................................41.2.4菌株的分子生物学鉴定....................................51.2.5酶的最适温度............................................51.2.6产酶曲线的测定..........................................52结果与分析........................................................52.1纤维素酶产生菌的筛选........................................52.1.1葡萄糖标准曲线..........................................52.1.2初筛结果................................................52.1.3复筛结果...............................................62.2菌株形态的观察...............................................72.3菌株的分子生物学鉴定.........................................72.4酶促反应最适温度.............................................72.5产酶曲线.....................................................83结论..............................................................8参考文献............................................................91产低温纤维素酶微生物的筛选与鉴定辛悦（甘肃农业大学食品与工程学院生物工程专业，甘肃兰州，730070）摘要：纤维素酶主要应用于生物质能源发酵的前处理过程,低温纤维素酶在工业生产中也越来越被关注。本试验从天祝地区高寒草地的土样若干中筛选出一株可降解纤维素的菌株，通过菌落形态观察和分子生物学技术对该菌株进行鉴定，并将其命名为XMS-4。研究表明：菌株XMS-4为革兰氏阳性,无芽孢,直杆菌,无鞭毛，经鉴定为鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumfaeciumstrain),能在低温下分解纤维素,具有较大的潜在工业应用价值。关键词：低温;纤维素酶；筛选；鉴定；Screeningandidentificationofcold-adaptedcellulase-producingmicroorganismXinYue（MajorinBiologicalEngineeringintheCollegeofFoodScienceandEngineeringofGansuAgricultureUniversity，GansuLanzhou，730070）Abstract:Cellulaseismainlyappliedinpro-treatmentprocessofbiomassfermentation,whichhasattractedmoreattentioninindustrialproduction.Inthistest,adegradationcellulasewasscreenedfromseveralstrainssoilsamplesofbacteriainalpinemeadow,Throughthecolonymorphologyobservationandmolecularbiologytechnologytoidentifythestrain,andnameditXMS-4.TestshowthatstrainXMS-4forgram-positive,buds,straightbacillus,noflagella.PreliminaryidentificationofSphingobacteriumfaeciumstrain(Sphingobacteriumfaeciumstrain),candecomposecelluloseundercold-adapted,theindustryhasgreatpotentialapplicationvalue.Keywords:cold-adapted;cellulase;screening;identifying;前言纤维素是植物纤维的主要成分，也是自然界中丰富的可再生资源[1]。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4糖苷键连接而成的多聚化合物，其基本重复单位为纤维二糖，是自然界最丰富的生物聚合物[2]。据报道，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55×109吨，其中89%尚未被人们利用[3]。纤维素利用最大难题是由于纤维素本身的结构特点而不容易被降解，许多研究表明利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的一条有效途径。纤维素酶是指能降解纤维素分子生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一2组酶的总称。目前广泛应用于纺织、食品、可再生资源利用等领域的纤维素酶几乎都是中温纤维素酶(最适作用温度45°C−65°C)[4]。低温纤维素酶主要指最适作用温度为15°C−35°C的酶,与中温纤维素酶相比,低温纤维素酶在自然条件下具有高酶活力及高催化效率,可大大缩短处理过程的时间,节省加热或冷却费用,并且经过温和的热处理即可使其失活,不会影响产品品质。因此,其应用对于减少工艺流程、降低生产成本以及节能方面有相当大的优势[5−7]。目前有关高效低温纤维素酶的研究报道较少。天祝地区海拔高、空气干燥且稀薄、昼夜温差大、辐射强度大。特殊的地理、气候环境孕育了历史悠久的牧区文化，同时蕴藏着极为丰富、独特的微生物种质资源。近年来人们对于该地区的乳酸菌、产乳糖酶微生物和产脂肪酶微生物等进行了研究，但对该地区产低温纤维素酶微生物的报道较少。本研究拟从甘肃天祝高寒草甸采集土壤样品，从中分离筛选低温纤维素酶微生物并对其进行鉴定，以期为开发低温纤维素酶奠定基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1样品本实验土样取自天祝高寒区，采集土样地点为多年堆积枯枝落叶处，地面有很厚的腐殖质层，其中枯枝落叶大部分已被分解为碎末，取样时取距土壤界面2cm处的土壤，样品取回来后保存于4℃冰箱。1.1.2培养基筛选培养基：羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)0.5%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.1%，琼脂2%，pH7.0-7.2。种子培养液：PDA培养基---200g土豆，20g葡萄糖，定容至1000mL。发酵产酶培养基：酵母膏1.00%，蛋白胨1.00%，NaCl0.50%，CMC-Na0.50%，pH7.0-7.2。1.1.3主要试剂0.1mol/LpH6柠檬酸缓冲液，标准葡萄糖溶液,DNS试剂,CMC-Na溶液.1%刚果红，1%NaCl溶液，结晶紫等。1.1.4主要仪器AL204电子天平；TGL-20台式高速冷冻离心机；双人单面超净工作台；生3化培养箱；立式电热压力蒸汽灭菌锅；HWS26型电热恒温水浴锅；恒温摇床；754PC型可见分光光度计；GZX-GF101-II电热恒温鼓风干燥箱。1.2实验方法1.2.1纤维素酶产生菌的初筛1.2.1.1土壤稀释液的制备分别称取采集的样品10.0g，加到含有玻璃珠的90mL无菌水的三角瓶（250mL）中，25℃，180r/min摇床中培养30min。取其上清液1mL加入到9mL无菌水中,稀释成合适的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度,然后通过涂布法接种于纤维素平板分离培养基之上,培养于25℃恒温培养3d[8]。1.2.1.2菌种的初筛将培养出来的菌株,分别接种到另外一个培养基上,保持对应关系,进行培养。将一定量1mg/ml浓度的刚果红溶液倒入培养好的对应平板中盖住平板上层,染色1h,之后倒出刚果红溶液,再用1mol/LNaCl比溶液浸泡洗脱,倒出NaCl溶液,若菌株产纤维素酶,则会在菌落周围出现清晰的透明圈,依据透明圈直径的大小选择产酶菌株[9]。用游标卡尺测量菌菌落周围水解透明圈的直径(d1)和菌落直径(d2),并以两者的比值(HC值）大小作为初步判断分解能力的指标,将比值较大的菌落挑取到选择培养基上培养,作进一步产酶水平的测定和纤维素酶高产菌株的筛选[10]。1.2.2纤维素酶产生菌的复筛1.2.2.1粗酶液的制备在250mL三角瓶中装100mL种子培养基，分别将X株菌株接种，25℃旋转摇床振荡培养24h作种子液。无菌条件下用1000µL移液枪量取5mL转接于250mL三角瓶中100mL液体发酵产酶培养基中，在25℃摇床培养72h，在4℃，8000r/min离心10min，取上清液作为粗酶液[11]。1.2.2.2羧甲基纤维素酶（CMCase）活力的测定（1）原理Teather等认为，对数酶浓度同刚果红染色水解圈存在线形关系，产酶越多，透明圈越大；产酶越快，透明圈出现越早。然而，虽然透明圈大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力。试验表明，液体样品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系，可以对酶活进行初步定量，但不能作为菌株产酶活力大小的唯一定量指标。因为刚果红纤维素平板筛选法受菌苔大小、菌苔在平板上的堆积情况、菌落之间相互位置和产物或分泌物的相互抑制、不同菌株4生长和产酶速度、不同细菌细胞壁的特性等因素的影响，并不能精确反应纤维素酶活力的大小[12]。因此本试验最初以水解圈的大小来判定纤维素降解能力，进而筛选出纤维素降解能力较强的菌株。然后采用DNS法来测定纤维素酶活力的大小。（2）测定方法以1mL1.0%CMC溶液为底物，加1mL上清液，摇匀于25℃反应40min，取出后迅速加入1.5mLDNS试剂，沸水浴煮5min，以终止反应，然后放入凉水冷却至室温，加入1.5mL的柠檬酸缓冲溶液，在540nm测光密度值(O.D.)；以相应空白样（1mL1.0%CMC溶液为底物，1mL灭菌的发酵培养液,于25℃反应40min，然后加人1.5mLDNS试剂，沸水浴煮5min，然后一起放入凉水冷却至室温，再加入1.5mL