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红河学院生命科学与技术学院遗传学实验[教学讲义]专业：生物科学2016-2017学年秋季学期红河学院-1-实验室规章制度及安全教育一、实验室规则、安全要求和实验要求（一）、《四防》安全措施为保证实验室安全，使国家的财产不受损失，保证教学科研工作的顺利进行，特制定本措施。a必须重视安全技术工作，加强对安全工作的领导和检查。要定期对实验室安全人员的工作和所辖各实验室的工作进行检查。b各实验室必须配备消防灭火器材，放置在固定、明显、易取之处，并定期检查维修。c使用电量较大、化学试剂较多的实验室还必须准备灭火用的沙箱。d实验室电器设备和线路安装要符合安全标准，做实验使用电炉等加热设备时，教师与学生都不能远离以免发生火灾。e实验室严禁烟火，禁止在实验室吸烟。f对易燃、易爆、剧毒化学试剂要严格控制，并有专人管理。g各种气瓶必须有安全阀、压力表，并定期检修，各种气瓶必须远离火源，易燃与助燃气瓶分开放置。h使用高压灭菌锅要事先检查放气阀、安全阀，并严格遵守操作规章，以免发生事故。（二）、玻璃器皿、器材的赔偿制度根据红河学院实验室与设备管理部有关实验室管理制度的规定，破损仪器的学生按仪器原价值的30%的赔偿规定，生物实验中心现规定作出如下制度：a学生损坏或丢失显微玻片标本、玻璃仪器和器械后，填写仪器破损单，然后找实验管理人员，给予调换。b学生在实验前如发现玻璃仪器已破损，及时向实验管理人员报告，给予调换。c学期结束，根据各班仪器破损单汇总，30%进行赔付，由于违反纪律和实验管理规定损坏的仪器设备需要按玻璃仪器原价的60%赔付。d所赔专款用于补充显微玻片标本、玻璃仪器和器械等实验用品。赔偿款相统一交院财务部门由学院统一管理。（三）、开放式实验要求红河学院-2-a参加实验的同学必须自觉登记进入和离开实验室的具体时间。并按编排好的座位对号入座开展实验。b各实验小组所用的实验材料以及配好的试剂，应贴好标签，只能在指定的工作座位范围内整齐有序地摆放，不得任意摆放其他地方。c正确使用仪器设备，不得随意拆装，使用后要按要求如实登记。d节约使用试剂、药品，使用量要如实在指定的小本子上登记，称药前后要把药匙抹净，注意不能交叉污染，用完后要放回原处。e对有毒、有害、危险的药品、试剂，要做好有效防护措施，用完后要按规定进行妥善处理，不能随意乱放和直接排入下水道。f进入实验室后，必须保持实验室安静、整洁、有序，不得带任何食物进入实验室，不得在实验室大声喧哗，相互追逐打闹。g当值人员要负责当天实验室的卫生（扫地、拖地）工作，关好水电，并把当日实验室的情况在指定的本子上登记。二、考核要求：（一）成绩构成课程总成绩由平时成绩和期末成绩构成。其中平时成绩70%分为预习15%、实验操作20%、实验态度5%、实验数据记录作业10%和实验结果分析及报告写作20%；期末考核成绩占30%。（二）考勤要求迟到，每次从总成绩扣3分；缺席，每次从总成绩中扣10分，两次以上不准参加考试；请假须事前提交班主任签字的假条，并在上课其他时段补上该实验，否则认作缺席。三、实验安排：进度周次课时教学内容（章节）1实验室卫生打扫、实验说明、安全教育23实验一植物有丝分裂及减数分裂的观察33实验二动物有丝分裂及减数分裂的观察43实验三微核检测技术（一）53实验三微核检测技术（二）63实验三微核检测技术（三）红河学院-3-73实验四微生物诱变（一）83实验四微生物诱变（二）93实验四微生物诱变（三）103实验五孟德尔遗传定律的观察（一）113实验五孟德尔遗传定律的观察（二）123实验五孟德尔遗传定律的观察（三）133实验六人类性状的遗传分析14期末考核红河学院-4-实验一植物有丝分裂及减数分裂的观察一、目的a掌握植物有丝分裂的过程，观察染色体的动态变化规律；b掌握高等植物花粉形成过程中的减数分裂过程，观察染色体的动态变化规律；c学习并掌握植物染色体观察常用的制片方法。二、原理有丝分裂是生物体细胞增殖的主要方式。在有丝分裂过程中，细胞核内染色体准确的复制，均等分裂，使母子细胞在遗传物质组成上达到等质等量。观察植物有丝分裂常用根尖、茎尖及幼叶等部位的分生组织。解离作为实验操作的关键步骤，是影响制片效果的重要因素。减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂，仅在配子形成过程中发生。这一过程的特点是：细胞连续进行两次核分裂，而染色体只复制一次，减数分裂结束形成四个子细胞（配子），每个子细胞染色体数目减少一半（n）。经过受精作用，雌雄配子融合为合子，染色体数目又恢复母细胞的水平（2n）。这样在物种延续的过程中确保了染色体数目的恒定，从而使物种在遗传上具有相对的稳定性。另外，在减数分裂过程中包含的同源染色体配对、交换、分离和非同源染色体的自由组合，充分体现了遗传的三大规律，在丰富基因的多样性中起着重要的作用。三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器、用具显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、吸水纸（二）材料大葱花药、蚕豆根尖（三）试剂乙醇、冰醋酸、改良苯酚品红染色液、0.1％秋水仙碱，或饱和对二氯苯溶液，70％乙醇，0.1％升汞，１mol/L盐酸四、方法与步骤（一）减数分裂1、取材：在一朵花的减数分裂的全过程中能观察染色体的时间是很短的，因此，红河学院-5-适时取材是观察花粉母细胞减数分裂的关键步骤。从现蕾开始，上午10：00-11：00可选取2-3mm大小的花莆或一小段花序。将采集的材料置于卡诺氏固定液12-24h，后用70%乙醇冲洗至无乙酸味，并放入70%乙醇中存于4℃冰箱中，随时取用。2、染色、制片：用蒸馏水将从保存瓶中取出的花蕾冲洗干净，置载玻片上，用解剖针剥开花蕾将花药剔出，切开花药，加一滴改良苯酚品红染色液染色10min，边染色边用镊子轻轻捣碎花药，最后用镊子除去残渣，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周多余的染液。3、镜检：在显微镜下检查花粉母细胞、二分体、四分体以及各个时期的细胞。花粉母细胞与一般体细胞的区别是细胞外有一层较厚的透明胼胝质壁，同时，细胞体积较近似等径的多角形，核也较大。先用低倍镜观察，找到一个好的分裂相时再转用高倍镜观察。要求能够将减数分裂的各个时期分辨清楚，特别是对前期的各时期能够独立辨认。第一次减数分裂分为前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ和末期Ⅰ，各时期特征如下：前期Ⅰ：减数分裂的前期Ⅰ时间很长，此时期染色体逐步折叠、浓缩。同时出现非姊妹染色体的节段交换现象。人们根据细胞核及染色体的形态变化将前期工划分为五个时期。即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。细线期：细胞核膨大，染色质浓缩、凝聚成染色丝，染色丝上有许多染色粒。DNA虽然已经复制，但还看不出双线结构。此时由于染色体盘绕扭曲而分不清头尾。偶线期：进行同源染色体的配对，即联会（synapsis）。配对后的同源染色红河学院-6-体形成二价体，但是尽管此时染色体比细线期清楚，但染色体仍很细长，所以也不能辨清染色体数目。粗线期：染色体明显缩短变粗，同源染色体配对完毕，形成四价体。双线期：染色体进一步缩短，配对的同源染色体开始分开。由于染色单体间起过交换，同源染色体的相互吸引力消失，因此形成了不同形状的交叉图像。终变期：染色体交叉数减少，染色体浓缩得最短，染色体呈现各种如“O”、“8”、“X”、“V”形。核仁、核膜消失。此时进行染色体计数十分方便中期Ⅰ：配对的染色体排列在赤道面上，同源染色体的着丝粒与细胞两端的纺锤丝相连。如果制备的细胞是从极面压成的标本，则可看到同源染色体排列成环形。是染色体计数的好时机。后期Ⅰ：同源染色体在纺锤丝的牵引作用下，分别向细胞两极移动。每个染色体有一着丝粒，带着两个染色单体。每一极得到n条染色体，染色体数已减半。末期Ⅰ：染色体移到两极后聚集在一起，并逐步解旋而恢复到染色质状态。随后核仁、核膜重新出现，进行胞质分裂而形成两个子细胞。经过一个简短的间期后，就进入第二次减数分裂，第二次减数分裂分为前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ和末期Ⅱ。由于经过了减数第一次分裂，同源染色体己经分离，染色体数目已经减半，所以从形态上看第二次分裂的细胞体积较小。前期Ⅱ：与末期Ⅰ紧密相连，时间短暂。在形态上与末期Ⅰ相似。中期Ⅱ：同一着丝粒连接的染色单体排列在赤道面上，形成赤道板。后期Ⅱ：着丝粒分裂，因此两条姊妹染色单体分离，在纺锤丝的牵引下染色单体向细胞两极移动。末期Ⅱ：染色体到达两极后，逐步解旋形成染色质，核仁、核膜重新出现。形成四个子细胞。细胞体积较小，形态与间期细胞类似。经过生长、发育、变态过程逐渐形成梭型的精子。红河学院-7-（二）有丝分裂装片制备1、发根：将材料种子用0.1％升汞消毒10min，经流水冲洗，温水浸泡1～2d后，置恒温箱中发根。待主根长到2cm左右时剪去主根（须根系植物的种子发出的主根不需剪掉），让其充分长出侧根。待侧根长到1～2cm时，于适宜时间用蒸馏水洗净，将水吸干，剪取根尖0.5～1cm进行预处理。为获得尽可能多的分裂相，应注意取材时间。2、预处理：将剪下的根尖立即放入0.1％秋水仙碱或饱和对二氯苯水溶液中，以药液浸没根尖为度，处理3～4h。抑制和破坏纺锤丝的形成，使根尖细胞延迟其染色体的分离，增加中期分裂相，并使染色体分散于细胞中，以便观察计数。3、固定：材料经预处理后，用流水冲洗，然后投入卡诺液Ⅰ（3份甲醇∶1份冰乙酸，现配现用）中固定20～24h，用95％的乙醇洗两次，转入70％乙醇中保存备用。固定的目的是将材料迅速杀死，并使染色体形态、结构尽可能保持不变和便于染色。4、解离：常用酸解法：从70％乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗３min→吸水纸吸干→放入盛有适量1mol/LHCl，60±0.5℃水浴保温的青霉素瓶中→解离10min。5、染色：改良石炭酸品红染色：解离后材料水洗3min并吸干，取1/2个根尖的乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2滴染液，染色10～15min，压片。6、压片：在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。7、镜检：通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数，因此压片后要认真仔细地进行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化，找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数，对好的分裂图像作上标记，以便再观察。（三）注意事项：a酒精和解离液都要清洗干净，并认真吸干，否则影响染色效果。红河学院-8-b染色时间10分钟是个参考时间，应以实际染色效果判断，不太长也不能太短。c镊子敲打时，应用力均匀，开始不要太重，避免细胞挤压在一起。用力太轻不易使细胞处于同一平面，故应适当控制敲打力度。（四）结果观察：间期：在光学显微镜下，只看到均匀一致的细胞核及许多的丝状染色质。实质上间期的核是处于高度活跃的生理生化的代谢阶段，正为细胞分裂准备条件。前期：核内染色质逐渐浓缩为细长而卷曲的染色体，每一染色体含有两个染色单体，它们具有一个共同的着丝点；核仁和核膜逐渐模糊不明显。中期：核仁、核膜逐渐消失，各染色体排列在赤道板上，纺锤丝与染色体的着丝点相连。染色体分散，易于鉴定形态、数目。后期：各染色体着丝点分裂为二，其每条染色单体也相应地分开，并各自随着纺锤丝的收缩而移向两极，每极有一组染色体，数目和原来的相同。末期：分开在两极的染色体各自组成新的细胞核，在细胞质中央赤道板处形成新的细胞壁，使细胞分裂为二，形成二个子细胞。这时细胞进入分裂间期。五、作业a绘图示减数分裂和有丝分裂各时期，并叙述其典型特征。b记录不同解离条件下所制装片的镜检情况，找出较适合的解离条件。红河学院-9-实验二动物有丝分裂和减数分裂的观察一、目的a了解植物和动物细胞分裂的区别；b掌握动物细胞有丝分裂和简述各个分裂时期的代表典型特征的照片；c掌握动物染色体制片的方法。二、实验原理制作染色体标本的先决条件：1、细胞具有旺盛的分裂能力（a.选择活跃的组织如睾丸，骨髓。b.施加药物使细胞分裂如PHA）。2、设法得到大量中期细胞，秋水仙素处