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第7章生物催化剂—酶Enzymes羧肽酶本章主要内容酶的一般概念酶的组成与维生素酶的结构与功能的关系酶的催化机理酶反应的动力学酶活性的调节1.酶的概述酶是生物催化剂。绝大部分酶是蛋白质，还有一些核糖核酸RNA具有催化作用，称为核酶（ribozyme）。1.1定义细胞的代谢由成千上万的化学反应组成，几乎所有的反应都是由酶（enzyme）催化的。酶对于动物机体的生理活动有重要意义，不可或缺。酶在生产实践中有广泛应用。1.2酶的命名（1）习惯命名——依据所催化的底物（substrate）、反应的性质、酶的来源等命名。例如，胃蛋白（水解）酶、碱性磷酸酶。（2）系统命名——根据底物与反应性质命名反应：葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ADP命名：葡萄糖：ATP磷酰基转移酶（习惯名称，葡萄糖激酶）1.3酶的分类氧化还原酶AH2+BA+BH2转移酶Ax+CA+Cx水解酶AB+H2OAH+BOH裂解酶AB+C异构酶AB合成酶A+BC，需要ATP1961年酶学委员会（EnzymeCommission，EC）规定酶的表示法：EC.X.X.X.X例如：乳酸脱氢酶1.4酶活性(enzymeactivity)酶活性的表示方法：酶活性指的是酶的催化能力，用反应速度来衡量，即单位时间里产物的增加或底物的减少。V=dP/dt=-dS/dt测定方法：吸光度测定、气体分析、电化学分析等。酶活性的计量：EC1961年规定：在指定的条件下，1分钟内，将1微摩尔的底物转变为产物所需要的酶量为1个酶活国际单位（IU）。比活性（specificityofenzyme）指的是每毫克酶蛋白所具有的酶活性单位数。比活性=活性单位数/酶蛋白重量（mg）比活性反映了酶的纯度与质量。酶促反应的速度曲线随着酶催化的反应进行，反应速度会变慢，这是由于产物的反馈作用、酶的热变性或副反应引起的。但是，在反应起始不久，在酶促反应的速度曲线上通常可以看见一段斜率不变的部分，这就是初速度。在酶的动力学研究中，一般使用初速度的（V0）概念。高效性酶的催化作用可使反应速度比非催化反应提高108-1020倍。比其他催化反应高106-1013倍例如：过氧化氢分解2H2O22H2O+O2Fe3+催化，效率为6×104mol/mol.s过氧化氢酶催化，效率为6×106mol/mol.s专一性即对底物的选择性或特异性。一种酶只催化一种或一类底物转变成相应的产物。1.5酶的特点绝对专一性一种酶只催化一种底物转变为相应的产物。例如，脲酶只催化尿素水解成CO2和NH3。相对专一性一种酶作用于一类化合物或一类化学键。例如，不同的蛋白水解酶对于所水解的肽键两侧的基团有不同的要求。立体专一性指酶对其所催化底物的立体构型有特定的要求。例如，乳酸脱氢酶专一地催化L-乳酸转变为丙酮酸，延胡索酸只作用于反式的延胡索酸（反丁烯二酸）。立体专一性保证了反应的定向进行。R1:Lys,ArgR2:不是ProR3:Tyr,Trp,PheR4:不是Pro酶容易变性这是酶的化学本质（蛋白质）所决定的。酶的可调节性抑制和激活（activationandinhibition）反馈控制(feedback)酶原激活(activationofproenzyme)变构酶(allostericenzyme)化学修饰(chemicalmodification)多酶复合体(multienzymecomplex)酶在细胞中的区室化(enzymecompartmentalization)已知的上千种酶绝大部分是蛋白质单纯酶：少数，例如：溶菌酶（催化水解细菌多糖细胞壁）结合酶：大多数结合酶=酶蛋白+辅因子辅因子包括:辅酶、辅基和金属离子。2.酶的组成与维生素2.1酶的化学本质酶蛋白的作用：与特定的底物结合，决定反应的专一性。辅酶、辅基的作用：参与电子的传递、基团的转移等，决定了酶所催化反应的性质。有十几种.辅酶与辅基的异同点:它们都是耐热的有机小分子，结构上常与维生素和核苷酸有关。但是辅酶与酶蛋白结合不紧，容易经透析除去，而辅基通常与酶蛋白共价相连。金属离子的作用：它们是酶和底物联系的“桥梁”；稳定酶蛋白的构象；酶的“活性中心”的部分。结合酶举例，()内为辅因子：乳酸脱氢酶（辅酶I,NAD）异柠檬酸脱氢酶（辅酶I,NAD）醇脱氢酶（辅酶I,NAD）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（辅酶II,NADP）琥珀酸脱氢酶（FAD）乙酰辅酶A羧化酶（生物素，ATP，Mg++）脂酰辅酶A合成酶（辅酶A,CoA）维生素（Vitamin）是动物和人类生理活动所必需的，从食物中获得的一类有机小分子。它们并不是机体的能量来源，也不是结构成分，大多数以辅酶、辅基的形式参与调节代谢活动。脂溶性维生素：A视黄醇（维生素A原——胡萝卜素）D钙化醇E生育酚K凝血维生素水溶性维生素：B族维生素和维生素C（以下主要介绍B族维生素与辅酶、辅基的关系）2.2维生素与辅酶、辅基的关系B族维生素及其辅酶、辅基形式B族维生素辅酶、辅基形式在酶催化反应中的作用硫胺素(B1)硫胺素焦磷酸酯(TPP)α-酮酸的氧化脱羧核黄素(B2)黄素单核苷酸(FMN)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氢原子转移氢原子转移尼克酰胺或称烟酰胺(PP)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)氢原子转移氢原子转移吡哆醇(吡哆醛、吡哆胺，B6)磷酸吡哆醛氨基转移泛酸辅酶A(CoA)酰基转移叶酸四氢叶酸“一碳基团”转移生物素(H)生物素羧化作用钴胺素(B12)甲基钴胺素5′-脱氧腺苷钴胺素甲基转移VB1，硫胺素经焦磷酸化转变为TPP，焦磷酸硫胺素。它是酮酸脱氢酶的辅酶。以VB2，核黄素为基础形成两种辅基FMN黄素单核苷酸和FAD黄素腺嘌呤二核苷酸。作用是传递氢和电子。H2NN+SCH3NCH3NPOOOHHOOPOHO硫胺素焦磷酸硫胺素TPPH8796N10N5RNH142OHN3ON10OHOHNOHN5OOHNONNNNNH2OOHOHOPOOO-POO-FMNFADH2e-+2H+2e-+2H+尼克酸，烟酸（维生素Vpp）NAD+/NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化/还原）NADP+/NADPH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化/还原）。烟酰胺衍生物，传递氢和电子，氧化还原酶的辅酶。NNNNH2NOOOHOPOOHOPOOHOOOHOHNNH2OPOHOHONAD+NADP+NNH2ORHH2e-+H+2e-+H+泛酸（维生素B3）是CoA（辅酶A）的组成成分。CoA是脂酰基的载体。吡哆醛和吡哆胺（吡哆素），维生素B6。磷酸吡哆醛是氨基酸转氨酶、脱羧酶等的辅酶。NOOHPOOHONOOHPOOHOH2N磷酸吡哆醛磷酸吡哆胺ONNNNH2NOOPOHOOOPOOHOHOHNHNOSHOHOOHPHOO巯基乙胺泛酸3′-磷酸腺苷酸叶酸，其还原衍生物四氢叶酸是一碳基团转移酶的辅酶。一碳基团，如甲基、乙烯基、甲酰基等。生物素，维生素H。噻吩和脲缩组成，CO2的载体，羧化酶的辅酶，且有戊酸侧链。OHNHOHNSOOHNHONSOOHO生物素羧基生物素OHOHNOHN1096N54OHN32H2NN1N87OHO2-氨基-4羟基-6甲基蝶呤对氨基苯甲酸谷氨酸蝶酸叶酸（蝶酰谷氨酸）硫辛酸，含硫脂肪酸，其巯基有氧化和还原两种形式，既可以传递氢和电子，又能转移脂酰基。维生素B12中心钴原子结合5’-脱氧腺苷基称辅酶B12，为一些变位酶和转甲基酶的辅酶。NNNNH2NONH2ONH2NH2OOOCoOHH2NONHORPOO-OONNHOHHNH2HHOH氰钴胺酸：R=-CN羟钴胺酸：R=-OH甲钴胺酸：R=-CH35′-脱氧腺苷钴胺酸：R=5′-脱氧腺苷3+单体酶只有三级结构，一条多肽链的酶。如129个氨基酸的溶菌酶，分子量14600。寡聚酶含2-60个亚基，有复杂的高级结构。常通过变构效应在代谢途径中发挥重要的调节作用。例如，乳酸脱氢酶。多酶复合体由多个功能上相关的酶彼此嵌合而形成的复合体。它可以促进某个阶段的代谢反应高效、定向和有序地进行。例如，由三个酶组成的丙酮酸脱氢酶系。3.酶的分子结构酶的活性中心（activesite）与酶的催化活性有关的基团称为必需基团活性中心内的必需基团必需基团活性中心外的必需基团结合基团（与底物结合，决定专一性）活性中心催化基团（影响化学键稳定性,决定催化能力）酶的活性中心示意图活性中心是酶分子上由催化基团和结合基团构成的一个微区化学反应是由具有一定能量的活化分子相互碰撞发生的。分子从初态转变为激活态所需的能量称为活化能。无论何种催化剂，其作用都在于降低化学反应的活化能，加快化学反应的速度。一个可以自发进行的反应，其反应终态和始态的自由能的变化（∆G’）为负值。这个自由能的变化值与反应中是否存在催化剂无关。4.酶的催化机理4.1活化能催化剂降低了反应物分子活化时所需的能量非催化反应和酶催化反应活化能的比较Ea，活化能；ΔG，自由能变化S+EESP+E中间产物反应过程S+EESES*EPP+E过渡态复合物4.2中间产物学说酶介入了反应过程。通过形成不稳定的过渡态中间复合物，使原本一步进行的反应分为两步进行，而两步反应都只需较少的能量活化,从而使整个反应的活化能降低。形成过渡态中间复合物是关键。诱导契合学说认为，酶和底物都有自己特有的构象，在两者相互作用时，一些基团通过相互取向，定位以形成中间复合物。4.3诱导契合学说（inducedfit）邻近与定向效应：增加了酶与底物的接触机会和有效碰撞。张力效应：诱导底物变形，扭曲，促进了化学键的断裂。酸碱催化：活性中心的一些基团，如His，Asp作为质子的受体或供体，参与传递质子。共价催化：酶与底物形成过渡性的共价中间体，限制底物的活动，使反应易于进行。疏水效应：活性中心的疏水区域对水分子的排除、排斥，有利于酶与底物的接触。4.4催化机理影响酶促反应速度的因素与酶作为生物催化剂的特点密切有关。这些因素有：温度、酸碱性、底物（substrate）浓度、酶浓度、激活剂（activators）和抑制剂（inhibitors）等。5.酶促反应的动力学及其影响因素一般来说，随着温度升高，化学反应的速度加快。在较低温度条件下，酶促反应也遵循这个规律。但是，温度超过一定数值时，酶会因热变性，导致催化活性下降。最适温度（optimumT）：使酶促反应速度达到最大时的温度。最适温度因不同的酶而异，动物体内的酶的最适温度在370C-400C左右。有的温泉微生物的酶非常耐热，也有的酶在较低的温度下活性反而高。5.1温度对酶促反应速度的影响酶反应的温度曲线和最适温度5.2溶液pH值对酶促反应速度的影响最适pH（optimumpH）：使酶促反应速度达到最大时溶液的pH。酶的最适pH与酶的性质、底物和缓冲体系有关。在最适pH时，酶和底物之间有最好的结合状态。在其他条件确定时，反应速度与酶的浓度成正比。5.3酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响5.4底物浓度对酶促反应速度的影响在其他条件确定的情况下，在低底物浓度时，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应。当底物浓度较高时，v也随着[S]的增加而升高，但变得缓慢，表现为混合级反应。当底物浓度达到足够大时，反应速度也达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。反应速度对于底物浓度的变化呈双曲线，称为米氏双曲线，其数学表达式为米氏方程.米氏双曲线米氏方程的推导首先假设：1.反应在最适条件下进行2.pH、温度和酶的浓度固定，变化的是底物浓度3.反应在起始阶段，逆反应可忽略4.反应体系处在稳态（stablestate）E+SESE+Pk+1k-1k+2根据中间产物学说，在稳态时，ES中间复合物的生成速度与其分解速度相等，并有以下关系式：V1=V-1+V+2(1)k+1[E][S]=k-1[ES]+k+2[ES]=[ES]（k-1+k+2）[E][S]=[ES]（k-1+k+2）/k+1(2)令（k-1+k+2）/k+1=Km(米氏常数)[E][