5-DNA复制突变修复

第一节DNA的复制一、DNA复制的一般特征（一）半保留复制（semireservativereplication）Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA分子的复制提供了理论基础，即亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制(semiconservativereplication)。第四章DNA的复制、突变、损伤和修复大肠杆菌细胞在15N培养基（重培养基）中培养数代，产生含重氮（15N）的大分子（包括15N-DNA分子），而后移到正常培养基（14N）上培养，在不同时间提取DNA样品并在CsCl溶液中超速离心。Cscl溶液在超速离心下形成密度梯度。DNA分子在该密度梯度中迁移，并在与其密度与溶液密度相同点达平衡。E.coligrownmanygenerationsin15Nmedium(Heavy)15N14NGrowin14Nmedium(light)andsampledaftervariousgenerationsExtractDNAfromcellandcarryout“densitygradientcentrifugation”（二）复制起点、复制子、复制叉、复制方向和复制终点1.复制起点（originofreplication）DNA的复制是在DNA分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点，常用ori来表示。原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制。许多生物的复制起点都是富含AT配对的区域，因为AT之间是二价氢键，GC之间是三价氢键，AT比GC更易解开。富含AT的区域经常处于开放与闭合的动态平衡状态，称为DNA的呼吸作用。这一区域能产生瞬时单链，单链与单链结合蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，ssb)结合，对复制的起始十分重要。2.复制子（replicon）：复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点（origin）以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。一个DNA分子可以是一个复制子，如细菌的染色体；也可以是几个复制子，如许多真核细胞的染色体。一个失去复制点的DNA分子不能独立进行复制，但是当它的另一个复制子连接起来时，就能在后者的带动下进行复制。3.复制叉（replicationfork）：DNA分子复制时复制起点两条链解开成单链状态，两条单链分别作为模板，各自合成其互补链，这种Y型的结构成为复制叉。复制叉从复制起点沿DNA链移动，不断扩大直到整个复制子完成复制。4.复制方向：从复制起点开始，大多数进行双向复制，形成两个复制叉，分别等速或不等速复制，少数以单向进行，形成一个复制叉①双向复制（bidirectionalreplication）：从固定起始点开始，以双向等速复制方式进行复制，即从原点开始在两个方向各有一个复制叉在延伸，直至与邻近的复制叉汇合，这种方式为双向复制。有的生物两个复制叉移动不对称，如枯草杆菌DNA从原点开始双向复制，一个复制叉移动1/5就停下来，另一个复制叉走完4/5的距离。②单向复制（unidirectionalreplication）：有一些DNA复制单向进行，如质粒colE1，从复制起点开始，单方向进行。A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC未复制DNA起点单向复制起点复制叉双向复制DNA的单向或双向复制5.复制终点：①环状DNA复制终点：以大肠杆菌（E.coli）为例：EcoliDNA的两个复制叉一直行进到特殊的终止位点复制终止。现已发现E.coli有两个终止区域（terD,A和terC,B），每一终止序列对某一方向移动的复制叉来说是特异的。终止需要tus基因的产物，其编码蛋白能识别ter信号序列，并阻止复制叉继续前进。有的环状DNA没有特定的终止位点，如λ噬菌体。②线状DNA分子的复制终点：问题：根据半保留复制理论，新链复制开始时，首先在5’端合成一段RNA引物，当复制完成后将引物切除，5’端出现一段空缺，由于5’没有游离3’-OH存在，所以无法通过DNA聚合酶将这一段新链中空缺补上。这样随着DNA分子的不断合成，DNA新链会越来越短。但实际上细胞中线状DNA的长度是恒定的。很多线状复制子在复制循环中采取环形构象解决。T7噬菌体的串联体模型：T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子代DNA的3'端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′互补的3′端配对3′5′3′5′PolI和连接酶封闭缺口3′5′3′5′3′5′5′3′限制性酶交错切割3′5′3′5′3′5′3′5′PolI3‘端延伸完成复制（三）DNA复制的酶学DNA复制过程需要多种酶和蛋白参与。大肠杆菌DNA复制过程需要的酶研究的最清楚。1.使DNA链解离的酶⑴解旋酶（helicase）：DNA复制时，首先由解旋酶通过水解ATP获得能量，沿5'→3'方向解开DNA双链。E.coli中鉴定出了四种DNA解旋酶。其中dnaB编码的产物DnaB在DNA复制中起作用，真核生物中，也分离纯化了多种DNA解旋酶。⑵单链DNA结合蛋白（single-strandDNA-bindingprotein，SSB）：这类蛋白选择性结合并覆盖在单链DNA上，防止DNA复制过程中，解开的DNA单链被酶水解及重新结合成双链。每个蛋白分子可覆盖32nt（nucleotide）。SSB还可作用于DNA中富含AT区域由于呼吸作用形成的单链。⑶DNA旋转酶（topoisomerase，又称拓扑异构酶Ⅱ）：大多数天然DNA都具有负超螺旋。负超螺旋有利于复制叉的形成并可以缓解由于复制叉的移动而造成的超缠现象。由于DNA是双螺旋结构，所以两条链分离时必须旋转。当5%的环形DNA双链已经复制时，原有的负超螺旋已耗尽。在复制叉处解旋，会使复制叉前方双链进一步扭紧，产生正超螺旋，影响复制叉向前推进。这时由拓扑异构酶切断DNA双链松开正超螺旋并重新使DNA双链连接，形成负超螺旋，DNA旋转酶作用一次产生两个负超螺旋。2.DNA聚合酶（DNApolymerase）⑴原核细胞中的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ），这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。PolⅠ只有一条多肽链，分子量102kda，它是一个多功能酶。主要有3种作用：①5'→3'的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3'→5'的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5'→3'外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移（nicktranslation）中应用。Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.DNA聚合酶Ⅰ的另一个重要特点是：通过温和的蛋白水解反应，PolI的多肽链断裂为两部分：①一个是比较大的片段称为Klenowfragment，具有3’到5’的外切酶活性和5’到3’的聚合酶活性。②另一断裂片断较小，具有的5’到3’外切酶活性。Klenowfragment常用于分子生物学技术上的DNA的合成。可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，要用被切成平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。1971年ThomasKornberg和MalcolmCefter发现了两个新的DNA聚合酶，PolⅡ，PolⅢ。DNA复制需要polⅢ。不需要polⅡ.PolⅢ全酶由、、、、、、、’、、10种不同的亚基组成。其中三个亚基、、组成polⅢ的核心：亚基有DNA聚合酶活性，亚基有3'到5'核酸外切酶活性。亚基功能不清楚。大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修复修复复制功能⑵真核细胞中的DNA聚合酶：α：在DNA复制中起主要作用，与随后链合成有关；δ：在DNA复制中起主要作用，与领头（前导）链合成有关，具有3′-5′端核酸外切酶的活性；β：修复功能；γ：位于线粒体中，与线粒体DNA复制有关；ε：具3′-5′端核酸外切酶的活性；附属蛋白：具3′-5′端核酸外切酶的活性。真核细胞内有五种DNA聚合酶细胞核＞15’→3’外切酶－高蚜肠霉素修复细胞核23’→5’外切酶－有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成线粒体23’→5’外切酶－高双脱氧TTP线粒体DNA合成细胞核1－－低双脱氧TTP修复细胞核4－＋中等蚜肠霉素引物合成定位亚基数目外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能DNA聚合酶εDNA聚合酶δDNA聚合酶γDNA聚合酶βDNA聚合酶α（四）DNA的复制过程1．DNA双螺旋的解旋DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程.2．冈崎片段与半不连续复制（semidiscontinuousreplication）因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是5’—3’方向，另一条是3’—5’方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—3’方向，不是3’—5’方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。1968年冈崎（Okazaki）及其同事进行了一系列实验，回答了这一问题。。1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超离心方法得到了许多3H标记的，被后人称作冈崎片段的DNA。延长标记时间后，冈崎片段可转变为成熟DNA链，因此这些片段必然是复制过程中的中间产物。另一个实验也证明DNA复制过程中首先合成较小的片段:即用DNA连接酶温度敏感突变株进行试验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量小DNA片段积累，表明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶链成大分子DNA。原核生物的冈崎片段比真核生物的长。深入研究还证明，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性，故称为DNA双螺旋的半不连续复制。两条新链具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment前导链(Leadingstrand))和后随链(laggingstrand)的协调合成二、原核生物的DNA复制（一）大肠杆菌（E.coli）基