5-6细菌的遗传分析2014打印.

微生物作为遗传研究材料的优越性•作为遗传研究材料具有独特优势，了解微生物遗传研究有助于理解多年来分子生物学、分子遗传学理论发展。–世代周期短，繁殖世代所需时间短；–易于操作管理和进行化学分析(纯培养与代谢产物累积)；–便于研究基因的突变(表现与选择)；–便于研究基因的作用(突变型生长条件与基因作用)；–便于研究基因的重组(重组群体大、选择方法简便有效)；–遗传物质比较简单，可作为研究高等生物的简单模型；–在研究基因结构、功能与表达调控时更为简便。同时：微生物的应用领域日益扩大、成就突出(微生物工程)；在遗传工程(包括动植物)中，作为重要研究材料、工具，也具有决定性作用。第六节细菌的遗传分析二、细菌遗传的实验研究方法(一)细胞计数(培养物细胞浓度)(二)建立纯系的方法(三)选择培养法鉴定突变型与重组型(四)突变型与重组型的批量筛选方法(一)细胞计数(培养物细胞浓度)•培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实验技术，其基本思路是：–对原培养物进行连续稀释；–进行平板涂布（或混合倒平板）培养；–由于每个细胞形成一个菌落，计数菌落数；–根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。(二)建立纯系的方法——纯培养(三)选择培养法鉴定突变型与重组型•许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件有关。•营养缺陷型的筛选、鉴定：–选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原生营养型)与营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长)。•其它突变类型的筛选、鉴定：–对于其它的突变类型(如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。(四)突变型与重组型的批量筛选方法•选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，仅采用选择培养法要进行多次试验才能够达到目的、效率太低。•为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了影印培养法。–该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选择培养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。细菌的基因组nucleoid(+plasmid)1结构:P107环状双链DNA，单倍性，以折叠或螺旋状态存在；2大小：长约250~35000m(未螺旋)；3复制方式：着膜式复制。分裂特点：均等分裂，无基因重组。Plasmidp108-109图7-3大肠杆菌染色体的基本结构图解细菌的突变型(一)合成代谢功能的突变型anabolicfunctionalmutants:营养缺陷型，auxotroph,X-(二)分解代谢功能的突变型：catabolicfunctionalmutants:lac-等(三)抗性突变型resistantmutants1抗药性突变型:青霉素:penr,pens链霉素:strr,strspenicillinStreptomycin抗性:resistance敏感:sensitive，susceptive2抗噬菌体突变型T1噬菌体TonrTonsT2噬菌体TtorTtosT6噬菌体TsxrTsxs突变型的筛选例如：营养缺陷型的筛选:u.v野生型细菌完全培养基：影印培养基本培养基：补充培养基：氨基酸类维生素类系列氨基酸补充培养基：赖氨酸脯氨酸精氨酸….CMMMSM影印实验（replicaplating）JoshuaLederberg&EstherLederberg（1952）在细菌中遗传物质有三种转移的形式。•转化（transformation）•接合（conjugation）•转导（transduction）其共同特点是：（1）单方向转移；（2）都产生部分二倍体；（3）外源基因只有整合到环状染色体上才能稳定地遗传。(一)细菌转化实验(二)转化过程(三)共转化与遗传图谱绘制转化一、细菌的转化与作图转化(transformation)：指外源DNA片段不经中间媒介体直接进入感受态细胞进行基因重组形成重组体的过程。转化子：通过转化而形成的重组体。P99证明DNA是遗传物质的经典实验一：转化实验感受态与感受态因子：–感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。–感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。–一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用Ca2+(如CaCl2)处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。按照细菌出现感受态的方式，可把转化分为三种类型1.自然转化(naturallyoccuringtransformation)：细菌自发地出现感受态，如肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，枯草杆菌等。2.人工诱导的感受态(artificiallyinducedcompetence)：如Ca2+诱导的大肠杆菌等发生的转化。3.原生质体转化(protoplasttransformation)：将DNA分子连同PEG一同加入原生质体，造成细胞摄取DNA。还可以用电穿孔法(electroporation)代替PEG，用高压脉冲电流在细胞膜上击成小孔，使DNA分子通过小孔而导入细胞，又称为电转化。可适用于多种细菌，放线菌和真核细胞的转化。2和3：工程转化（engineeredtransformation）转化过程图7-13细菌转化的机制•通过转化可以测定基因的连锁、基因的排列顺序以及图距。原理如下：•如果在供体的染色体上有两个离得很远的基因a＋和b＋，我们将会发现它们总是在不同的DNA片段上，这样如果有一个a＋b＋供体和ab受体，那共转化（cotransformation）即两个基因同时转化的概率是由两个基因单独转化的概率的乘积。若每个基因的转化频率是10－3的话，那么这两个基因同时被转化的频率应为10－3×10－3＝10－6。•如果两个基因离得很近，有可能位于同一个DNA片段上，那么它们共转化的频率将接近于单个基因转化的频率。•若共转化的频率要比两个单个基因转化频率相乘积高的话，那么这两个基因一定是紧密连锁的。(三)共同转化与遗传图谱绘制•基因的顺序也可以通过共转化的结果来分析确定，例如p＋和q＋常常共转化，而q＋和o＋也常常共转化，但基因p＋和o＋从未发生共转化，那么这三个基因的顺序一定是p–q-o。•由于转化片段的大小是可以控制的，因此两个基因共转化的频率可以和转化片段的平均大小相等。通过转化片段平均大小相关的共转化频率测定，就可以获得这些基因的连锁图谱。•利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：–相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。–因此可能通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。2转化基因间重组值的计算a、b单个整合个体数a、b单个整合+同时整合总体数重组值==(+-)+(-+)(++)+(+-)+(-+)P93q21出现野生型菌落的可能原因：回复突变；转化；互养；细菌间发生了基因重组细菌的接合与染色体作图几种可能解释及其分析•对上述试验结果原养型菌落可能产生于：–亲本细菌A或B发生了回复突变；–两品系细胞通过培养基交换养料——互养作用；–两品系间发生了转化作用；–发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。•为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。回复突变可能的排除•Lederberg和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。–单基因回复突变的频率约为10-6；–双基因回复突变的频率则为10-12，频率很低。–但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基本可以排除回复突变的可能。互养作用及其排除•试验材料：–A品系：A-B+T1s(met-bio-thr+leu+T1s)；–B品系：A+B-T1r(met+bio+thr-leu-T1r)。•试验方法：–将A、B品系混合接种在基本培养基表面；–短时间后喷T1杀死A品系，使其不能持续产生Thr与Leu供B品系持续生长。•结果与结论：–仍然出现原养型菌落。–从而表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。转化作用及其排除•Lederberg和Tatum曾把品系A的培养液经加热灭菌，加入到B品系的培养物中，未得到原养型菌落；表明原养型菌落可能不是由转化作用产生。•戴维斯(Dawis,1950)的U型管试验(结果没有得到原养型细菌)；•实验结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件。异核体和杂合二倍体的可能性•出现原养型菌落的另一种可能是细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这两种情况类似于二倍体生物的杂合体将产生原养型菌落。–异核体指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两个或多个细胞核。–双杂合二倍体则是异核体进一步发生核融合，形成二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。•但细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存在。培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落。•对试验中得到的原养型菌落后代研究表明：–后代没有出现预期的性状分离现象。•经过上述分析可以认为：–在Lederberg和Tatum及其它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为接合（conjugation）。由于历史的局限，从一开始莱德伯格和塔特姆就根据真核的重组来解释他们的发现，认为细菌接合是一个彼此交换遗传物质的过程。F因子及其在杂交中的行为•致育因子(fertilityfactor,F因子;sexfactor,性因子)。•F因子的化学本质是DNA，可以自主状态存在于细胞质中或整合到细菌的染色体上。•F因子可以在细菌细胞间进行转移并传递遗传物质。图F因子的结构图F因子的整合F因子状态与遗传物质转移特点FfactorF因子状态与遗传物质转移特点不能进行极少转移Ｆ因子,大量转移细菌基因。转移Ｆ因子，还转移细菌个别基因。Ｆ因子状态游离整合菌株类型Ｆ+FˊＨfrＦ-菌株性别♂♀杂交类型Ｆ+Ｆ-FˊＦ-ＨfrＦ-Ｆ-Ｆ-传递特点只转移Ｆ因子不转移细菌基因。F+F-(1)F纤毛(Fpili)由纤毛素(pilin)蛋白构成，接合管仅使细胞初步接触；(2)转移启动转移起始区(transferorigin,OriT),滚环复制；(3)单链转移，复制，或重组。HfrF-(1)F整合后呈线状；(2)转移起点0riT位于中间；(3)先转移F因子的一部分,F的后面部分最后转移。（4）重组子仍为F-高频重组菌株P125异源双链三细菌基因重组的特点１部分二倍体:指含有一个完整基因组和部分基因组的细胞.(半合子)P85内基因子:P85外基因子:P85２细菌基因重组的特点:(1)细菌基因重组是在部分二倍体中进行;(2)只有偶数交换才产生有活性的重组体;(3)相反的重组体不出现.5-36中断杂交与重组作图一、中断杂交实验原理1中断杂交实验Hfrthr+leu+azirtonrlac+gal+strsF-thr-leu-azistonslac-gal-strr选择培养基9′11′18′25′加str↓↓↓↓无thr,leu↓↓↓影印接种aziTonlacgal┆┆┆接合中断接合杀死Hfr检查基因作图2中断杂交实验作图原理A：Hfr染色体上的基因是从某一点开始,以线性方式进入Ｆ-的,B：离原点愈近的基因进入Ｆ-愈早,出现在Ｆ-中的比例愈大,反之,则愈小.3中断杂交作图:指在HfrF-杂交中,把接合中的细菌在不同时间取样,搅拌中断杂交,分析受体菌基因型,以Hfr基因出现在Ｆ-中的先后为顺序,以转移的时间(分钟)为图距单位进行基因作图的方法.4作图(原点)aziTonlacgalF09111825min大肠杆菌基因组很大（全部转移需要100分钟），其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成。1)不同的Hfr品系转移的起始基因是不同的;说明：Ｆ因子可以在不同的位点插入细菌染色体;2)与同一基因相